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分为中度局灶性神经功能缺损（即行走困难，并向左侧                           阳性表达水平越高。
        倾倒），4 分为重度局灶性神经功能缺损（即不能自发行                         2.5 统计学方法
        走、意识水平下降）；并以激光多普勒检测大鼠脑血流                               采用SPSS 26.0软件进行统计分析。若数据符合正
        量。当大鼠神经学评分为 1～3 分且脑血流量降至其基                         态分布且方差齐，则以 x±s 表示，多组间比较时采用单
        础值的 20％左右，并在再灌注 2 h 后脑血流量恢复至其                      因素方差分析，组间两两比较时采用 LSD 检验；若不符
        基础值的50％以上，则表明造模成功。                                 合正态分布则以中位数表示，采用非参数检验。检验水
        2.2 大鼠脑组织中NVU超微结构的观察                               准α＝0.05。
            造模成功后，各组取 2 只大鼠，腹腔注射 10％水合                     3 结果
        氯醛进行麻醉，并以生理盐水和 4％多聚甲醛进行心脏                          3.1 原儿茶醛对大鼠脑组织中NVU超微结构的影响
        灌流；灌流后，断头取大鼠额顶区脑组织，将其切成5片                              假手术组大鼠 BBB 结构完整，血管内皮细胞正常，
        厚度为 1 mm 的切片，以双醛固定液浸泡 3 次，每次 10                    基底膜厚薄均一；神经元结构正常、无明显变化，染色质
        min；以 2.5％戊二醛和 2％四氧化锇固定，梯度乙醇脱                      分布均匀；胶质细胞结构完好，细胞核、细胞器完整，周
        水，环氧树脂包埋；再以醋酸铀、枸椽酸铅双重染色，然                          围组织无水肿。模型组大鼠BBB结构被严重破坏，血管
        后采用透射电镜观察大鼠脑组织中 NVU 超微结构的                          腔变窄，内皮细胞外侧严重水肿，基底膜厚薄不一；神经
        变化。                                                元核固缩，周围组织存在大面积严重水肿；胶质细胞结
        2.3 大鼠脑组织中NVU相关蛋白表达的检测                             构严重破坏，胞体皱缩、细胞器损失。原儿茶醛各剂量
            采用Western blot法进行检测。各组取6只大鼠，腹                  组大鼠与模型组比较，其 BBB 损伤减轻，血管腔和基底
        腔注射10％水合氯醛进行麻醉，以生理盐水进行心脏灌                          膜形态未完全被破坏；神经元损伤减轻，神经元核固缩
        流后，迅速取出脑组织，置于冰上分离出缺血侧（右侧）                          减少，染色质均匀、异染色质减少；胶质细胞结构破坏减
        大脑皮层和海马组织，加入蛋白裂解液提取蛋白；以                            轻，详见图2。
        14 000 r/min离心10 min，分离上层蛋白液，采用BCA法                3.2  原儿茶醛对 CIRI 模型大鼠脑组织中 NVU 相关蛋
        检测蛋白浓度。蛋白经变性后进行十二烷基硫酸钠-聚                           白表达的影响
        丙烯酰胺电泳（SDS-PAGE），转膜，以 5％脱脂奶粉封闭                         与假手术组比较，模型组大鼠脑组织中MAP-2蛋白
        1.5 h；以 TBST 缓冲液清洗 5 min×3 次，加入 MAP-2、             表达水平显著降低（P＜0.05），GFAP、AQP-4蛋白表达水
        GFAP、AQP-4、β-actin 一抗（稀释度均为 1 ∶ 1 000），于           平均显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，原儿茶醛各剂
        4 ℃条件下孵育过夜；以 TBST 缓冲液清洗 5 min×3 次，                 量组大鼠脑组织中MAP-2蛋白表达水平有所升高，但差
        加入二抗（稀释度为1 ∶ 1 000），室温下孵育2 h；以TBST                 异无统计学意义（P＞0.05），而 GFAP、AQP-4（原儿茶醛
        缓冲液清洗5 min×3次，加入化学发光显影剂，采用显色                       低剂量组除外）蛋白表达水平均显著降低（P＜0.05），详
                                                           见表1、图3。
        系统成像。采用Image J v1.8.0软件进行分析，以目的蛋
                                                           表 1   各组大鼠脑组织中 NVU 相关蛋白表达水平的测
        白与内参蛋白（β-actin）的灰度值比值表示目的蛋白的表
                                                                 定结果（x±±s，n＝6）
        达水平。
                                                           Tab 1 Expression of NVU-related proteins in cerebral
        2.4  大鼠大脑皮层中NVU相关蛋白阳性表达的检测
                                                                  tissue of rats in each group（x±±s，n＝6）
            采用免疫荧光染色法进行检测。取对照组、模型组
                                                            组别               MAP-2       GFAP       AQP-4
        和原儿茶醛高剂量组大鼠各3只（因本课题组实验经费
                                                            假手术组            1.07±0.08   0.32±0.04  0.52±0.19
        有限，故仅选择了原儿茶醛高剂量组大鼠进行免疫荧光                            模型组             0.43±0.09 ＊  1.07±0.12 ＊＊  1.27±0.23 ＊＊
        染色实验），以生理盐水和 4％多聚甲醛进行心脏灌流                           原儿茶醛高剂量组        0.73±0.07   0.66±0.14 #  0.79±0.28 #
                                                            原儿茶醛低剂量组        0.64±0.15   0.63±0.11 #  1.19±0.37
        后，断头取大鼠脑组织，将脑组织于 20％蔗糖溶液和
                                                               注：与假手术组比较，P＜0.05， P＜0.01；与模型组比较，P＜
                                                                                     ＊＊
                                                                                                        #
                                                                              ＊
        30％蔗糖溶液中脱水过夜；取出脑组织，进行包埋、冰冻
                                                           0.05
        切片。切片晾干后，以 0.01 mol/L PBST 缓冲液冲洗 3
                                                                                    ＊
                                                               Note：vs. sham operation group， P＜0.05， P＜0.01；vs. model
                                                                                            ＊ ＊
        次×5 min，然后滴加MAP-2、GFAP、AQP-4一抗（稀释度                 group，P＜0.05
                                                                #
        分别为1 ∶ 100、1 ∶ 50、1 ∶ 500），于4 ℃条件下孵育过夜；以           3.3  原儿茶醛对 CIRI 模型大鼠大脑皮层中 NVU 相关
        0.01 mol/L PBST缓冲液冲洗5 min×3次，加入二抗（稀释               蛋白阳性表达的影响
        度为 1 ∶ 1 000），室温下孵育 40 min；以 0.01 mol/L PBST           与假手术组比较，模型组大鼠大脑皮层中MAP-2蛋
        缓冲液冲洗 5 min×3 次，封片。采用显微镜观察切片中                      白的阳性表达水平显著降低（P＜0.01），GFAP、AQP-4蛋
        大鼠缺血侧（右侧）大脑皮层中 MAP-2、GFAP 和 AQP-4                  白的阳性表达水平均显著升高（P＜0.01）；与模型组比
        的阳性表达情况。采用 Image J v1.8.0 软件计算各目的                  较，原儿茶醛高剂量组大鼠大脑皮层中MAP-2蛋白的阳
        蛋白阳性染色面积百分比，其值越大，则表示目的蛋白                           性表达水平显著升高（P＜0.01），GFAP蛋白的阳性表达


        中国药房    2021年第32卷第15期                                             China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 15  ·1813 ·
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