Page 35 - 《中国药房》2021年12期
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（批号 2012056G，规格 200 mL，1.8 g，作生理盐水用）购               书进行操作。
        自山东华鲁制药有限公司；其余试剂均为分析纯，水为                           2.7 大鼠肺组织中炎症因子和纤维化相关指标测定
        蒸馏水。                                                   取各组大鼠右肺组织适量，采用ELISA法以酶标仪
        1.3 动物                                             测定肺组织中炎症因子 IL-1β、IL-6 和纤维化相关指标
            健康成年雄性 SPF 级 SD 大鼠 48 只，体质量 180～               HA、LN、PC-Ⅲ、Col-Ⅳ含量，根据相应试剂盒说明书进
        250 g，由中国食品药品检定研究院提供，动物生产许可                        行操作。
        证号为SCXK（京）2017-0005。饲养环境通风状况良好，                    2.8  大鼠肺组织中TGF-β 1/Smad信号通路关键基因表
        室温为22～27 ℃，相对湿度为（50±5）％。所有大鼠均                      达测定
        自由摄食、饮水。                                               采用实时荧光定量 PCR 法进行测定。取各组大鼠
        2 方法                                               右肺组织适量，采用 Trizol 法提取总 RNA，以微量分光
        2.1 分组与造模                                          光度仪测定RNA的浓度后，将其反转录合成cDNA。按
            将大鼠随机分为正常对照组、模型组、阳性对照组                         荧光定量PCR试剂盒说明书方法配制反应体系，PCR反
       （吡非尼酮，0.163 g/kg，根据说明书规定剂量并按体表面                     应体系（50 μL）包含 2×Real SYBR Mixture 25 μL，10
          [11]
        积 换算所得）和扫日劳-4味汤低、中、高剂量组（0.899、
                                                           µmol/L上、下游引物各1 μL，cDNA模板 2 μL，ddH2O加
        1.798、3.596 g/kg，根据说明书规定剂量并按体表面积              [11]  至50 μL。按如下反应条件进行PCR扩增：95 ℃预变性
        换算得中剂量，低、高剂量分别为中剂量的0.5和2倍），
                                                           10 min；95 ℃变性 15 s，58 ℃退火 40 s，72 ℃延伸 20 s，
        每组8只。除正常对照组外，其余各组大鼠均按5 mg/kg
                                                           72 ℃再延伸2 min，共35个循环。根据GenBank数据库
        于气管内缓慢注射6 mg/mL博来霉素1次以复制特发性
                                                           （http：//ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）报道的TGF-β 1、Smad3
        肺纤维化模型      [12－14] 。若大鼠肺组织受损面积大于 50％
                                                           和Smad7的引物序列，应用DNASTAR 12.1软件设计并
                                    [15]
        则表示特发性肺纤维化模型成功 。
                                                           由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列与
        2.2  给药
                                                           产物长度详见表1。以β-actin为内参，采用2              －ΔΔCt 法计算
            从建模后的第 1 天开始，正常对照组和模型组大鼠
                                                           TGF-β1、Smad3和Smad7 mRNA的表达水平。
        分别灌胃等体积生理盐水，各药物组大鼠分别灌胃相应
                                                            表1    TGF-β1、Smad3、Smad7的引物序列与产物长度
        剂量的药液（均以生理盐水为溶剂），每天1次，给药体积
                                                           Tab 1  Primer sequences and product lengths of TGF-
        均为10 mL/kg，连续给药4周。
                                                                  β1，Smad3 and Smad7
        2.3  大鼠一般情况观察
                                                            基因名称                 引物序列               产物长度，bp
            观察实验过程中各组大鼠的活动、毛发、饮食、体质
                                                            TGF-β1       上游：5′-CGCAACAACGCAATCTATG-3′  340
        量等一般情况。                                                          下游：5′-ACCAAGGTAACGCCAGGA-3′
        2.4  大鼠肺的外观形态观察与样品采集                                Smad3        上游：5′-CCAGTGCTACCTCCAGTGTT-3′  431
                                                                         下游：5′-CTGGTGGTCGCTAGTTTCTC-3′
            于末次给药24 h后处死各组大鼠，立即观察其双肺
                                                            Smad7        上游：5′-GGCTTTCAGATTCCCAACTTC-3′  447
        的颜色、质地、形态、体积等外观变化；然后于腹主动脉                                        下游：5′-CGCCATCCACTTCCCTTGT-3′
        取血 5 mL，分离血清或血浆并于－80 ℃下冷藏，备用；                       β-actin      上游：5′-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3′  234
                                                                         下游：5′-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3′
        取左肺下叶组织适量，用 4％多聚甲醛溶液固定，备用；
                                                           2.9  统计学方法
        取右肺组织适量，经液氮速冻后于－80 ℃下冷藏，备用。
                                                               采用SPSS 19.0软件对数据进行统计分析。实验数
        2.5 大鼠肺组织形态学变化观察
                                                           据以 x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间
            取各组大鼠经固定的左肺下叶组织，制成病理切片
        并进行 HE、Masson 染色     [16－17] 。将染色后的切片置于光           两两比较采用 LSD 检验。P＜0.05 表示差异有统计学
                                                           意义。
        学显微镜下观察肺组织形态学变化，记录结果并进行病
        理评分。根据病变程度分别赋分：0 分，HE 染色结果显                        3 结果
        示（下同）受损面积为 0；1 分，受损面积小于 25％；2 分，                   3.1 大鼠的一般情况
        受损面积为26％～50％；3分，受损面积为51％～75％；                          正常对照组大鼠摄食饮水正常，能够正常行动，双
        4分，受损面积大于75％ 。                                     眼有神，皮毛柔顺。模型组大鼠摄食饮水日渐减少，行
                            [15]
        2.6  大鼠氧化和纤维化相关指标测定                                动迟缓，目光呆滞，皮毛粗糙、脱落严重，行为懒散，身体
            取各组大鼠血清和右肺组织适量，采用酶联免疫吸                         机能有明显下降，主要表现为肢体协调性差、动作不灵
        附测定法（ELISA）以酶标仪测定血清中 SOD 活性、                       敏。与模型组比较，扫日劳-4味汤各剂量组和阳性对照
        MDA 含量和肺组织中 HYP 含量，根据相应试剂盒说明                       组大鼠的上述症状和表现均明显好转。


        中国药房    2021年第32卷第12期                                            China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 12  ·1437 ·
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