Page 54 - 中国药房2021年11期

2.3.5 提取回收率与基质效应试验 取“2.1.1”项下 LWK-126 的质量浓度。以孵育 0 min 时 LWK-126 的质
LWK-126 贮备液适量，加入至经高温灭活的大鼠肝微 量浓度为参照，以其余各时间点LWK-126的质量浓度与
粒体孵育体系中，制成低、中、高质量浓度（0.1、2.5、10 参照的比值计算剩余百分率。实验平行操作 3 次。结
μg/mL）的质控样品溶液，按“2.2”项下方法处理后，取上 果，LWK-126 在空白组和阴性对照组孵育体系中孵育
清液按“2.3.1”项下条件进样分析，记录峰面积（A1 ）。将 60 min 时的剩余百分率在 101.3％～108.8％（以平均值
经高温灭活的大鼠肝微粒体孵育体系按“2.2”项下方法 表示）范围内，表明可用本研究所创建的肝微粒体孵育
处理后，加入LWK-126贮备液适量，制成与上述低、中、 体系对LWK-126的代谢特征进行探究，详见表4。
高质量浓度一致的样品溶液，按“2.3.1”项下条件进样分 表 4 LWK-126 在空白组和阴性对照组肝微粒体中孵
析，记录峰面积（A2 ）。以甲醇配制与上述低、中、高质量 育60 min时的剩余百分率（x±±s，n＝3，％％）
浓度一致的 LWK-126 溶液，按“2.3.1”项下条件进样分 Tab 4 Residual percentage of LWK-126 incubated in
析，记录峰面积（A3 ）。每种样品平行操作5次，计算提取 the liver microsomes of blank group and nega-
回收率和基质效应：提取回收率（％）＝（A1/A2 ）×100％， tive control group for 60 min（x±±s，n＝3，％％）
基质效应（％）＝（A2/A3 ）×100％，结果见表2。 组别 人肝微粒体 大鼠肝微粒体 比格犬肝微粒体
表 2 LWK-126 的提取回收率与基质效应试验结果 空白组 104.4±3.06 101.3±1.68 102.9±4.72
阴性对照组 104.3±5.74 105.6±3.48 108.8±5.40
（n＝5）
2.4.2 LWK-126 在不同种属肝微粒体中的剩余百分率
Tab 2 Results of extraction recovery and matrix ef-
测定 按“2.2”项下方法建立人、大鼠、比格犬肝微粒体
fect of LWK-126（n＝5）
孵 育 体 系 ，分 别 于 孵 育 0、5、10、20、30、60 min 时 按
理论质量浓度， 提取回收率，％ 基质效应，％
μg/mL x±s RSD x±s RSD “2.3.1”项下条件进样分析，并按标准曲线法计算体系中
0.1 91.42±3.11 3.40 95.30±5.55 5.82 LWK-126的质量浓度，再按“2.4.1”项下方法计算各时间
2.5 92.35±3.54 3.83 102.92±4.49 4.36
10 98.37±7.58 7.70 99.15±5.16 5.20 点LWK-126的剩余百分率。实验平行操作3次。结果，
2.3.6 稳定性试验 取“2.1.1”项下 LWK-126 贮备液适 LWK-126 在人、大鼠肝微粒体孵育体系中在 5～10 min
量，加入至经高温灭活的大鼠肝微粒体孵育体系中，制 时消除最快，而在比格犬肝微粒体孵育体系中则是 0～
成低、中、高质量浓度的孵育样品溶液（0.1、2.5、10 5 min时消除最快。LWK-126在人、大鼠、比格犬肝微粒
μg/mL），各 5 份。各样品按“2.2”项下方法处理后，分别 体 中 孵 育 60 min 时 的 剩 余 百 分 率 分 别 为（33.17 ±
在室温放置24 h、4 ℃冰箱中冷藏24 h、常温至－80 ℃反 4.52）％、（3.14±6.73）％、（1.38±5.85）％，详见表5。
复冻融 3 次后，按“2.3.1”项下条件进样分析，记录峰面 表 5 LWK-126 在不同肝微粒体中的剩余百分率（x±±
积，代入回归方程计算质量浓度。结果，各孵育样品溶 s，n＝3，％％）
液质量浓度的 RSD 均小于 10％，表明 LWK-126 孵育样 Tab 5 Residual percentage of LWK-126 in different
品溶液在上述条件下稳定性良好，详见表3。 liver microsomes（x±±s，n＝3，％％）
表3 LWK-126的稳定性试验结果（n＝5） 孵育时间，min 人肝微粒体 大鼠肝微粒体 比格犬肝微粒体
5 107.72±2.27 103.52±5.06 39.75±3.57
Tab 3 Results of stability tests of LWK-126（n＝5）
10 74.29±3.21 53.59±3.26 27.52±4.45
室温放置24 h 冷藏24 h 反复冻融3次 20 68.20±1.92 32.59±4.32 8.05±2.20
理论质量浓度，
μg/mL 实测质量浓度 RSD， 实测质量浓度 RSD， 实测质量浓度 RSD， 30 54.82±3.98 18.65±2.13 3.43±4.74
（x±s），μg/mL ％ （x±s），μg/mL ％ （x±s），μg/mL ％ 60 33.17±4.52 3.14±6.73 1.38±5.85
0.1 0.114±0.005 4.38 0.108±0.007 6.48 0.101±0.004 3.96 2.4.3 LWK-126在肝微粒体中的酶动力学参数计算 在
2.5 2.742±0.257 9.37 2.460±0.152 6.18 2.852±0.194 6.80
10 9.526±0.541 5.68 10.517±0.475 4.52 10.635±0.526 4.95 人、大鼠、比格犬肝微粒体中，以LWK-126剩余百分率的
2.4 LWK-126在肝微粒体中的代谢稳定性 自然对数（y）与孵育时间（x）进行线性回归分析，得
2.4.1 肝微粒体孵育体系建立的验证 为考察待测物 LWK-126 在人、大鼠、比格犬肝微粒体中的回归方程
2
是否受到非酶催化降解的影响，本研究按“2.2”项下方法 分别为 y 人＝－0.019 3x 人+4.557 1（R ＝0.994 3）、y 鼠＝
2
设立空白组（即肝微粒体孵育体系中加入经高温灭活的 －0.059 2x 鼠+4.590 0（R ＝0.998 7）、y 犬＝－0.123 7x 犬+
2
肝微粒体）和阴性对照组（即肝微粒体孵育体系中不加 4.602 6（R ＝0.992 6）。根据各线性回归方程的斜率计
入启动因子 NADPH 辅酶溶液）人、大鼠、比格犬肝微粒 算体外代谢的半衰期（t1/2 ）与清除率（CLint ）：t1/2＝－0.693/k
体孵育体系，分别于孵育 0、5、10、20、30、60 min 时按 （k是消除速率常数）、CLint＝[（0.693/t1/2 ）×孵育体积（mL）]/
“2.3.1”项下条件进样分析，并按标准曲线法计算体系中 肝微粒体质量（mg） 。结果显示，LWK-126在人、大鼠、
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·1328 · China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 11 中国药房 2021年第32卷第11期