Page 53 - 中国药房2021年11期

0.5 μg/mL。将上述各种属孵育体系放置在37 ℃恒温水 100
浴中，分别于孵育 0、5、10、20、30、60 min 时加入“2.1.2”
项下含内标的终止液 400 μL 终止反应；涡旋均匀，于 ％
4 ℃下以 16 000 r/min 离心 10 min，取上清液，用氮气流 相对丰度， 50
吹干；残渣用甲醇200 μL复溶，再次以16 000 r/min离心
10 min，取 上 清 液 适 量 进 样 分 析 ，考 察 各 个 时 间 点
0
LWK-126的质量浓度。每个孵育体系平行操作3次。 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00
2.3 LWK-126质量浓度的测定方法 时间，min
A.空白孵育样品
2.3.1 色谱条件与质谱条件 以 Waters BEH C18 （50 100
mm×2.1 mm，1.7 μm）为色谱柱，Waters VanGuard BEH
C18 （5 mm×2.1 mm，1.7 μm）为保护柱；以水（含 0.01％甲 ％
酸）为流动相A、乙腈（含0.01％甲酸）为流动相A进行梯 相对丰度， 50
度洗脱（0～0.5 min，5％A；0.5～4.5 min，5％A→98％A；
4.5～5 min，98％A→5％A）；流速为 0.4 mL/min；柱温为
0
30 ℃；进样量为2 μL。离子源为电喷雾电离源（ESI），离
0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00
子源温度为 100 ℃；毛细管电压为 1.5 kV，锥孔电压为 时间，min
B. LWK-126对照样品
30 V，脱溶剂气温度为 400 ℃，锥孔气流量为 50 L/h，脱 100
溶剂气流量为800 L/h；采用选择反应检测（SRM），采集
正离子，扫描范围为 m/z 50→1 200；数据采集分析软件 ％
为Masslynx V4.1，采集时间为5 min。 相对丰度， 50
2.3.2 专属性考察 分别取适量空白孵育样品（不含待
测物和内标，以高温灭活的大鼠肝微粒体为介质，其余
按“2.2”项下方法制得）、LWK-126对照样品（含待测物5 0
0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00
μg/mL 和内标 1 μg/mL，以高温灭活的大鼠肝微粒为介 时间，min
质，按“2.2”项下方法制得）和孵育15 min时的LWK-126 C. LWK-126孵育样品
注：1. LWK-126；2.内标
样品（大鼠肝微粒体，按“2.2”项下方法制得）各适量，按
Note：1. LWK-126；2. internal standard
“2.3.1”项 下 条 件 进 样 分 析 ，记 录 色 谱 图 。 结 果 ，
图2 孵育体系中LWK-126和内标的典型SRM图
LWK-126 的色谱峰峰形良好，保留时间约为 2.08 min， Fig 2 Representative SRM chromatogram of LWK-
孵育体系中内源性物质不干扰LWK-126的测定，表明该 126 and internal standard in the incubation
方法专属性良好，详见图2。 system
2.3.3 线性关系、定量下限与最低检测限考察 取
清液按“2.3.1”项下条件进样分析，记录峰面积，考察日
“2.1.1”项下LWK-126贮备液适量，加入至经高温灭活的
内精密度；连续测定3天，考察日间精密度。以实测质量
大鼠肝微粒体孵育体系中，制成LWK-126质量浓度分别
浓度与理论质量浓度进行比较以评价准确度，结果以相
为 0.05、0.1、0.5、1、2.5、5、10、15 μg/mL 的系列孵育样品
对误差（RE）表示。结果，定量下限质量浓度孵育样品与
溶液，按“2.2”项下方法处理后，取上清液按“2.3.1”项下
各质控样品的日内、日间 RSD 均小于 10％，RE 均在±
条件进样分析，记录峰面积。以 LWK-126 质量浓度（x，
6％之内，表明方法准确度和精密度良好，详见表1。
μg/mL）为横坐标、LWK-126 与内标的峰面积比值（y）为
表1 LWK-126的日内、日间精密度与准确度试验结果
纵坐标进行回归分析，得回归方程为 y＝11.16x+0.5
2
（R ＝0.999 2），结果表明LWK-126检测质量浓度的线性 （n＝5）
范围为0.05～15 μg/mL，定量下限为0.05 μg/mL，最低检 Tab 1 Results of intra-day and inter-day precision
测限为0.01 μg/mL（按信噪比3∶1计）。 and accuracy tests of LWK-126（n＝5）
2.3.4 准确度与精密度试验 取“2.1.1”项下 LWK-126 理论质量浓度， 日内精密度 日间精密度 RE，
μg/mL 实测质量浓度（x±s），μg/mL RSD，％ 实测质量浓度（x±s），μg/mL RSD，％ ％
贮备液适量，加入至经高温灭活的大鼠肝微粒体孵育体
0.05 0.052±0.003 5.77 0.054±0.004 7.41 0.81
系中，制成定量下限质量浓度（0.05 μg/mL）的孵育样品 0.1 0.098±0.006 6.12 0.101±0.008 7.92 1.00
溶液和低、中、高质量浓度（0.1、2.5、10 μg/mL）的质控样 2.5 2.685±0.238 8.86 2.457±0.125 5.09 －1.72
品溶液，各 5 份。各样品按“2.2”项下方法处理后，取上 10 10.567±0.155 1.47 10.814±0.509 4.71 5.67

中国药房 2021年第32卷第11期 China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 11 ·1327 ·