Page 43 - 《中国药房》2021年10期
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2.2.3  经固定的组织切片         每组另取 4 只小鼠，断头后             1％BSA的PBS稀释的p-JAK2、JAK2、p-STAT6、STAT6、
        将头部置于 4％多聚甲醛溶液中固定 1～3 天，再置于                        β-actin 一抗（稀释比例均为 1 ∶ 2 000），4 ℃孵育过夜；
        10％乙二胺四乙酸溶液中脱钙5天，分离自鼻尖往后10                         TBST 溶液洗涤 3 次，加入以含 1％BSA 的 PBS 稀释的
        mm 的鼻腔结构组织，样本依次经 20％、30％蔗糖溶液                       HRP标记的山羊抗兔IgG二抗（稀释比例为1∶2 000），室
        脱水后，用冰冻切片包埋剂包埋后切片，制得厚约 7 μm                        温下孵育1.5 h；以TBST溶液洗涤后，滴加ECL曝光液，
        的鼻黏膜冰冻组织切片，保存于－80 ℃冰箱中，备用。                         于化学发光检测仪下显影。使用 Image J V 1.8.0.112 软
        取剩余脾脏组织置于4％多聚甲醛溶液中固定1～3天，                          件进行分析，以目标蛋白与内参（β-actin）的灰度值比值
        用冰冻切片包埋剂包埋后切片，制得厚度约 7 μm 的脾                        表示目标蛋白的表达水平，并以 p-JAK2/JAK2 比值、
        脏冰冻组织切片，保存于－80 ℃冰箱中，备用。                            p-STAT6/STAT6比值分别表示JAK2、STAT6蛋白的磷酸
        2.3 小鼠鼻腔灌洗液中IL-4、IL-5、INF-γ含量检测                    化水平。以空白组为参照，以各组与空白组结果的比值
            取“2.2.1”项下各组 6 只小鼠的鼻腔灌洗液样本，按                   进行定量。试验重复3次。
        ELISA试剂盒说明书进行操作，使用酶标仪检测其鼻腔                         2.8 统计学方法
        灌洗液中IL-4、IL-5、INF-γ含量。                                 采用SPSS 21.0软件对数据进行统计分析。计量资
        2.4 小鼠鼻黏膜组织中炎症细胞浸润情况观察                             料以 x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间
            取“2.2.3”项下各组小鼠经固定的鼻黏膜冰冻组织                      两两比较采用 LSD 检验。P＜0.05 表示差异有统计学
        切片，经HE或甲苯胺蓝染色后封片，于正置显微镜下观                          意义。
        察其鼻黏膜组织中炎症细胞（嗜酸粒细胞和肥大细胞）                           3 结果
        的浸润情况并计数。
                                                           3.1  黄芪甲苷对 AR 模型小鼠鼻腔灌洗液中 IL-4、
        2.5  小鼠鼻黏膜和脾脏组织中 p-JAK2、p-STAT6 阳性                 IL-5、INF-γ含量的影响
        细胞计数检测
                                                               与空白组比较，模型组小鼠鼻腔灌洗液中IL-4、IL-5
            采用免疫荧光化学法进行检测。在室温下复温
                                                           含量均显著升高，INF-γ含量显著降低（P＜0.05）。与模
       “2.2.3”项下各组小鼠经固定的各组小鼠鼻黏膜和脾
                                                           型组比较，黄芪甲苷组小鼠鼻腔灌洗液中 IL-4、IL-5 含
        脏冰冻组织切片，以 pH 7.4 的磷酸盐缓冲液（PBS）洗
                                                           量显著降低，INF-γ含量均显著升高（P＜0.05），详见
        涤 3 次；用含 0.3％TritonX-100、5％BSA 的 PBS 室温孵
                                                           表1。
        育1 h后，分别滴加以含0.3％TritonX-100、5％BSA的PBS
                                                           表 1   黄芪甲苷对 AR 模型小鼠鼻腔灌洗液中 IL-4、
        稀释的兔 p-JAK2、p-STAT6 抗体（稀释比例为 1 ∶ 200），
                                                                 IL-5、INF-γ含量的影响（x±±s，n＝6，pg/mL）
        4 ℃孵育过夜；以 PBS 洗涤 3 次后，滴加以含 0.3％
                                                           Tab 1   Effects of astragaloside ⅣⅣ on the contents of
        TritonX-100、5％BSA 的 PBS 稀释的 CoraLite594 标记的
                                                                   IL-4，IL-5 and INF-γ in nasal lavage fluid of
        驴抗兔IgG二抗（稀释比例为1 ∶ 2 500），室温避光孵育2
                                                                   AR model mice（x±±s，n＝6，pg/mL）
        h。以PBS洗涤3次后，滴加含DAPI的抗荧光淬灭封片
                                                            组别           IL-4         IL-5         INF-γ
        液，于正置荧光显微镜下观察各组小鼠鼻黏膜和脾脏组
                                                            空白组         6.08±1.51    3.07±0.97   19.21±4.51
        织中 p-JAK2、p-STAT6 的阳性细胞并计数。实验重复                     模型组        15.16±2.67 ＊  10.18±1.65 ＊  13.56±1.51 ＊
        3次。                                                 黄芪甲苷组       9.37±2.07 #  6.21±1.43 #  17.40±2.46 #
        2.6  小鼠鼻黏膜和脾脏组织中ROS水平检测                                注：与空白组比较，P＜0.05；与模型组比较，P＜0.05
                                                                           ＊
                                                                                             #
                                                                             ＊
                                                                                               #
            取“2.2.2”项下各组小鼠的新鲜鼻黏膜和脾脏冰冻                          Note：vs. blank group，P＜0.05；vs. model group，P＜0.05
        组织切片，以PBS洗涤，加5 μmol/L DHE染液100 μL，于                3.2  黄芪甲苷对 AR 模型小鼠鼻黏膜组织中炎症细胞
        37 ℃孵育 30 min；以 PBS 洗涤后，于正置荧光显微镜下                  浸润的影响
        观察其鼻黏膜和脾脏组织中 ROS 水平。以空白组为参                             空白组小鼠下鼻甲黏膜和鼻底部黏膜组织中均未
        照，以各组与空白组结果的比值进行定量。实验重复                            见明显的嗜酸性粒细胞和肥大细胞浸润。模型组小鼠
        3次。                                                下鼻甲黏膜和鼻底部黏膜组织中均可见大量的嗜酸性
        2.7  小鼠脾脏组织中p-JAK2、JAK2、p-STAT6、STAT6              粒细胞，鼻底部黏膜附近可见大量肥大细胞浸润，嗜酸
        蛋白表达的检测                                            性粒细胞和肥大细胞数量均较空白组显著增加（P＜
            采用 Western bolt 法进行测定。取“2.2.2”项下各组             0.05）。黄芪甲苷组小鼠下鼻甲黏膜和鼻底部黏膜组织
        小鼠新鲜脾脏组织，经裂解、匀浆、静置后，以 13 000×g                     中均可见少量嗜酸性粒细胞，鼻底部黏膜附近可见少量
        离心 15 min，获取上清液。采用 BCA 法测定蛋白浓度                     肥大细胞浸润，嗜酸性粒细胞和肥大细胞数量均较模型
        后，于 100 ℃下变性 5 min。取变性后的蛋白样品经                      组显著减少（P＜0.05），详见图2（图中，嗜酸粒细胞被染
        SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并转移至PVDF膜上，以                        成红色）、图 3（图中，肥大细胞被染成紫蓝色，白边方框
        含5％BSA的TBST溶液室温封闭2 h后，分别加入以含                       为黑边方框区域的放大图）、表2。


        中国药房    2021年第32卷第10期                                            China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 10  ·1189 ·
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