Page 66 - 《中国药房》2021年第9期
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Veriti 型 PCR 逆转录仪（美国 Applied Biosystems 公司）、        养条件相同），待细胞生长密度达 80％左右时，用含
        KS260型控制型摇床（德国KIA公司）、Min-protean Tetra              0.25％乙二胺四乙酸（EDTA）的胰酶消化并传代至新的
                                  TM
        型垂直电泳系统和 ChemiDoc 型高灵敏度化学发光成                        培养皿中。
        像仪（美国Bio-Rad公司）等。                                   2.2 MGF药液和新鲜培养基的配制
        1.2 主要药品与试剂                                             精密称取MGF对照品适量，溶于DMSO中，制得浓
            MGF 对照品（批号 MUST-17040103，纯度 98.21％）             度为250 mmol/L的MGF母液，分装。临用前，将上述母
        购自成都曼斯特生物科技有限公司；盐酸二甲双胍对照                            液用完全培养基稀释至所需浓度。
        品（阳性对照，批号100664-201805，纯度98％）购自上海                       取 PA、OA 适量，加水于 75 ℃溶解后，趁热与 20％
        源叶生物科技有限公司；无脂肪酸牛血清白蛋白（BSA，                          无脂肪酸BSA[以pH为7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）溶解]
        批号 WXBC0994V，纯度 99％）购自北京索莱宝科技有                      混匀并滤过。临用前，用完全培养基稀释成含3％BSA、
        限公司；MTT 试剂（批号 QR14912）购自美国 MP Bio-                  1 mmol/L PA、2 mmol/L OA的新鲜培养基。
        medicals公司；二甲基亚砜（DMSO，批号RNBF2368）、棕                 2.3 细胞分组与IR模型建立
        榈酸（PA，批号 SLBW9894，纯度 98.5％）、油酸（OA，批                     取对数生长期的 HepG2 细胞适量，随机分为正常
        号 SLCC4023，纯 度 99％）均 购 自 美 国 Sigma 公 司 ；            组、模型组、阳性对照组（盐酸二甲双胍 5 mmol/L，剂量
        DMEM 高糖培养基（批号 8119081）、南美胎牛血清（批                     设置参考文献[12]并结合本课题组前期研究结果）和
        号2176398）、青霉素-链霉素双抗（批号15140122）、胰酶                  MGF 高、中、低剂量组（500、250、125 μmol/L，剂量设置
        （批号 2120649）均购自美国 Gibco 公司；葡萄糖氧化酶                   参考本课题组前期研究结果），每组设3个复孔。除正常
        法检测试剂盒（批号20180801137）购自南京建成生物工                      组加入含 3％BSA 的完全培养基外，其余各组细胞均参
        程研究所；三酰甘油（TG）试剂盒（批号 E1003）、胆固醇                      照文献[13]加入“2.2”项下新鲜培养基培养 24 h 以诱导
        （TC）试剂盒（批号 E1005）均购自北京普利莱基因技术                       建立IR模型。建模后，正常组、模型组和各药物组分别
        有限公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒（批号P0010）购自                        替换为不含或含相应药物的完全培养基继续培养。
        上海碧云天生物技术有限公司；彩色蛋白 Marker（批号                        2.4  细胞葡萄糖消耗量检测
        00784045）、5×十二烷基硫酸钠-聚丙酰胺凝胶电泳                            取对数生长期的HepG2细胞适量，以3×10 个/孔接
                                                                                                    4
        （SDS-PAGE）蛋白上样缓冲液（批号 VG299802）均购自                   种于96孔板中，按“2.3”项下方法分组、造模、给药，同时
        美国 Thermo Fisher Scientific 公司；TRIzol 试剂（批号         设置不含细胞的空白对照组。各组细胞培养24 h后，取
        213506）购自美国 Invitrogen 公司；Fast Start Universal      上清液，参照葡萄糖氧化酶法检测试剂盒说明书方法，
        SYBR Green Master 荧 光 定 量 试 剂 盒（ 批 号                以多功能酶标仪检测各孔的葡萄糖含量并计算葡萄糖
        04913914001）、Transcriptor cDNA Synth. Kit2 反转录试     消耗量：葡萄糖消耗量＝空白对照组葡萄糖含量－待测
        剂盒（批号 04897030001）均购自瑞士 Roche 公司；10×                组葡萄糖含量。弃去上清液后，各组细胞加入0.5 mg/mL
        RIPA裂解液（批号75）、兔β-肌动蛋白（β-actin）单克隆抗                  的 MTT 试剂适量，于室温下反应 10 min，使用多功能酶
        体（批号4970）、兔AMPK单克隆抗体（批号2603）、兔磷                     标仪检测各孔的光密度（OD）值，并计算细胞活力：细胞
        酸化 AMPK（p-AMPK）单克隆抗体（批号 2535）均购自                    活力＝（待测组细胞 OD 值－空白对照组 OD 值）/（正常
        美国CST公司；辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔                         组 OD 值－空白对照组 OD 值）。基于上述葡萄糖消耗
        IgG 二抗（批号 SA00001-2）购自美国 Proteintech 公司；            量和细胞活力计算校正葡萄糖消耗量：校正葡萄糖消耗
        ECL 发光液（批号 1939801）购自美国 Millipore 公司；扩              量＝葡萄糖消耗量/细胞活力。实验重复3次。
        增引物由上海生工生物工程股份有限公司设计、合成；                            2.5 细胞中TG、TC含量检测
        其余试剂均为分析纯，水为超纯水。                                        取对数生长期的 HepG2 细胞适量，以 1.2×10 个/孔
                                                                                                      5
        1.3 细胞                                              接种于6孔板中，按“2.3”项下方法分组、造模、给药。各
            人源 HepG2 细胞株购自中国科学院上海生命科学                       组细胞培养24 h后，弃去上清液，细胞用预冷PBS洗涤2
        研究院细胞资源中心。                                          次，加入RIPA裂解液充分混匀，静置10 min。收集各组
        2 方法                                                细胞裂解液，于 70 ℃加热 10 min，以 2 000 r/min 离心 5
        2.1  细胞培养                                           min，取上清液，参照相应检测试剂盒说明书方法，以多
            HepG2细胞复苏后，接种于含10％胎牛血清、1％青                      功能酶标仪检测各组细胞中 TG、TC 含量；同时，采用
        霉素-链霉素双抗的DMEM高糖培养基（以下简称“完全                          BCA 法测定各孔的蛋白浓度，用于校正 TG、TC 含量。
        培养基”）中，置于 37 ℃、5％CO2培养箱中培养（以下培                      实验重复3次。


        ·1084 ·  China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 9                                   中国药房    2021年第32卷第9期
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