Page 61 - 《中国药房》2021年第9期
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E-BC-K318-M）；PCR 引物由北京擎科生物科技有限公                    水分，并称质量，记为湿质量（W）；然后于80 ℃恒温干燥
        司合成（引物序列与产物长度见表 1）；其余试剂为实验                         箱中烘烤约 48 h 后，称质量，记为干质量（D）；计算肺组
        室常用规格，水为纯净水。                                       织W/D比值，以反映肺组织的水肿程度。
                  表1 PCR引物序列与产物长度                          2.5 大鼠肺组织病理学形态观察
          Tab 1 PCR primer sequence and product length         取“2.2”项下固定于10％甲醛中的各组大鼠右肺上
         基因名称             引物序列                  产物长度，bp    叶，经常规脱水、石蜡包埋、切片（厚度为3 μm）后，以HE
         TNF-α    上游：5′-GGGGGCCACCACGCTCTTCTGTC-3′  188    染液进行染色，然后于光学显微镜下观察大鼠肺组织的
                  下游：5′-GCTGCTCCTCCGCTTGGTGGTTT-3′         病理学形态变化，并拍照。
         IL-1β    上游：5′-CAGCTTTCGACAGTGAGGAGA-3′  139
                  下游：5′-TTGTCGAGATGCTGCTGTGA-3′            2.6  大鼠肺组织中TNF-α、IL-1β、IL-6、PGE2 mRNA的
         IL-6     上游：5′-GTTTCTCTCCGCAAGAGACTTC-3′  119     表达水平检测
                  下游：5′-TGTGGGTGGTATCCTCTGTGA-3′               采用逆转录（RT）-PCR 法进行检测。取“2.2”项下
                  上游：5′-CCCTGCCTTTCACAATCTTTGC-3′  170
         PGE2
                  下游：5′-CCGACAACAGAGGACTGAGC-3′            各组大鼠的左肺组织适量，按照试剂盒说明书方法操作
         GAPDH    上游：5′-GTGGAGAAACCTGCCAAGTATG-3′  227     提取总RNA，然后逆转为cDNA进行PCR。PCR反应体
                  下游：5′-GGTGGAAGAATGGGAGTTGAT-3′           系（10 µL）包括：PCR Mixture 5 µL，上下游引物各 0.5
        1.3 动物                                             µL，cDNA 2 µL，H2O 2 µL。反应条件为：95 ℃预变性 5
            本 研 究 所 用 动 物 为 健 康 SD 雄 性 大 鼠 ，体 质 量          min；95 ℃变性 15 s，60 ℃退火 15 s，72 ℃延伸 15 s，共
       （300±20）g，购于长沙天勤生物技术有限公司，动物生                        45 个循环。以 GAPDH 为内参，采 2         －ΔΔCt 法计算 TNF-α、
        产许可证号为 SCXK（湘）2019-0014。大鼠饲养于照明                    IL-1β、IL-6及PGE2 mRNA的表达水平。
        充足（12 h/12 h 光暗调节）、空调通风良好、相对湿度                     2.7  大鼠肺组织中NF-κB p65磷酸化和IκBα蛋白表达
        50％、室温22 ℃的条件下。                                    水平的检测啊
        2 方法                                                   采用Western blot法进行检测。取“2.2”项下各组大
        2.1  动物造模、分组与给药                                    鼠的左肺组织适量，剪碎，加入蛋白提取试剂，提取蛋白
            将 48 只大鼠随机分为空白对照组、模型组、地塞米                      质，利用组织匀浆仪制备组织匀浆，于冰上裂解30 min，
        松组（阳性对照，0.945 mg/kg，剂量为临床等效剂量的 3                   以 12 000 r/min 离心 5 min，取上清液，经 BCA 蛋白试剂
        倍）和金骨莲胶囊低、中、高剂量组（0.66、1.32、2.64 g/kg，              盒测定蛋白浓度后，加热变性处理10 min。取变性后蛋
        剂量为临床等效剂量的5、10、20倍），每组8只。空白对                       白 进 行 十 二 烷 基 硫 酸 钠 - 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳
        照组和模型组大鼠灌胃等体积水，其余组大鼠灌胃相应                           （SDS-PAGE）分离，转膜，以 5％脱脂奶粉封闭 1 h；分别
        药物（临用时以水溶解），每天给药2次，连续3天。末次                         加入NF-κB p65一抗（稀释比例1 ∶ 500）、p-NF-κB p65一
        给药后30 min，除空白对照组腹腔注射等体积生理盐水                        抗（稀释比例 1 ∶ 500）、IκBα一抗（稀释比例 1 ∶ 1 000）、
        外，其余组大鼠腹腔注射 LPS（10 mg/kg）以复制炎症模                    β-actin一抗（稀释比例1 ∶ 10 000），于4 °C条件下孵育过
        型。腹腔注射6 h后，于各组大鼠尾静脉取血，室温静置                         夜；以TBST清洗5 min×5次，加入二抗（稀释比例1∶3 000）
        20 min 后，以 3 000 r/min 离心 20 min，分离血清，然后采          室温孵育 1 h；以 TBST 清洗 5 min×5 次，加入 ECL 显色
        用 ELISA 法测定各组大鼠血清中 TNF-α的含量。如果                     后，置于凝胶成像系统中成像。采用 Alpha Ease FC 4.0
        各组大鼠血清中TNF-α较空白对照组显著升高，则表明                         软件分析图像，以 p-NF-κB p65 与 NF-κB p65 灰度值比
        模型建立成功。                                            值表示NF-κB p65蛋白的磷酸化水平，以IκBα蛋白与内
        2.2  取材                                            参β-actin的灰度值比值表示IκBα蛋白表达水平。
            确定造模成功后，于各组大鼠尾静脉取血，室温静                         2.8 统计学方法
        置 20 min 后，以 3 000 r/min 离心 20 min，分离血清样               采用SPSS 18.0软件进行统计分析。数据以x±s表
        品。取血后，采用颈椎脱臼法处死大鼠，剖取其双肺，将                          示，采用单因素方差分析进行多组间样本均数比较，组
        左肺保存于－80 ℃冰箱中，用于 PCR 和 Western blot 实              间两两比较采用LSD检验。P＜0.05表示差异有统计学
        验检测；将右肺上叶以 10％甲醛固定，用于肺组织病理                         意义。
        学形态观察；将右肺下叶用于肺组织W/D比值的测定。                          3 结果
        2.3 大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、PGE2的含量测定                3.1  金骨莲胶囊对炎症模型大鼠血清中TNF-α、IL-1β、
            取“2.2”项下各组大鼠血清样品，按相应试剂盒说明                      IL-6、PGE2含量的影响
        书 方 法 操 作 ，采 用 酶 标 仪 于 450 nm 下 测 定 血 清 中              与空白对照组比较，模型组大鼠血清中TNF-α、IL-1β、
        TNF-α、IL-1β、IL-6、PGE2的含量。                          IL-6、PGE2含量均显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，
        2.4  大鼠肺组织W/D比值测定                                  金骨莲胶囊低、中、高剂量组和地塞米松组大鼠血清中
            取“2.2”项下各组大鼠右肺下叶，用滤纸吸干其表面                      TNF-α、IL-1β（金骨莲胶囊低剂量组除外）、IL-6、PGE2含


        中国药房    2021年第32卷第9期                                              China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 9  ·1079 ·
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