Page 134 - 《中国药房》2021年07期
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则可介导 PER 和 CRY 的磷酸化，并增强其对 CLOCK-                    分子化合物具有十分重要的意义。目前，还没有发现作
                                  [11]
        BMAL1 异二聚体的抑制作用 ；泛素化影响钟蛋白的                          用于 PERs、BMAL1 等钟蛋白的小分子化合物，且已知
        稳定性，如 F-box 蛋白介导 PER 和 CRY 单体发生泛素                   的生物钟调节物也大多缺乏对蛋白亚型的选择性，因此
                              [12]
        化，而后被蛋白酶体降解 。翻译后修饰过程可显著影                            更具针对性的靶向筛选法将在进一步的研究中起到重
        响生物钟自主调控过程中的关键蛋白的活性和功能，对                            要作用。靶向筛选法的局限性主要表现在其研究范围
        于生理或病理情况下生物钟的调节与重置具有重要意                             仅限于直接作用于已知蛋白质结构的小分子化合物，而
        义，异常的翻译后修饰将导致生物钟节律的紊乱，例如                            无法筛选其他作用方式的化合物，例如影响钟蛋白的亚
                                                                                [4]
        在家族性晚期睡眠综合征中，PER蛋白磷酸化的缺失会                           细胞定位的小分子物质 。
                           [13]
        导致节律周期前移4 h 。                                       3  生物钟相关蛋白调控小分子化合物对钟基因的
        2 调控生物钟的小分子化合物的筛选和鉴定方法                              调控及应用
            生物化学和高通量筛选技术的发展使得从成千上                               生物钟与睡眠、代谢、情绪反应等多种生理活动息
        万的小分子物质中筛选出影响生物钟节律的小分子化                             息相关，研究人员也一直致力于探索生物钟调控药物对
        合物成为可能。目前，表型筛选法和靶向筛选法是筛选                            这些生理功能障碍引起的疾病的作用。数量众多的符
        与鉴定调控生物钟的小分子化合物的主要方法。                               合Lipinski规则的小分子化合物是具有潜力的生物钟调
        2.1 基于细胞表型的高通量筛选法                                   控药物，这些小分子化合物可结合生物钟相关蛋白并改
            基于细胞表型的高通量筛选方法以无偏差方式筛                           变其生物活性，从而影响钟基因的表达以起到调控生物
        选影响生物钟节律的小分子化合物，该方法依赖高通量                            钟的作用    [3，16] 。最初，研究人员使用基于表型的高通量
        筛选技术和信息技术从众多特征良好的化合物中挑选                             筛选法鉴定出多种影响钟蛋白翻译后修饰过程的小分
                                              [14]
        出能显著改变细胞节律表型的小分子化合物 。                               子化合物，发现蛋白激酶（如 CK1、CK2、GSK-3）为其主
            该方法对小分子化合物的作用靶点和作用机制没                           要的作用靶点；最近，研究人员尝试使用小分子化合物
        有限制，能更全面地筛选出影响生物钟的小分子化合                             直接靶向调控钟基因的核心蛋白，包括 CRY、核受体
        物；并且在确定候选化合物的作用靶点时，有可能发现                           （REV-ERB、ROR）和 CLOCK。下文将分别描述靶向多
        新的节律相关蛋白和作用机制。表型筛选法还能直接                             种生物钟相关蛋白的小分子化合物对钟基因和生物钟
        筛选出强烈影响生物钟动态的小分子化合物，并能对化                            的影响，及其在相关疾病中的应用。
        合物的功能表现进行明确的鉴定与选择。但广泛而全                             3.1  靶向蛋白激酶
        面的筛选也造成了该方法的局限性，由于筛选容量庞                                 蛋白激酶参与的翻译后修饰在生物钟的调控中具
        大，对实验处理的精确性、一致性要求高，因此较难获得                           有重要作用，蛋白激酶的突变可能参与了多种由于生物
        高质量和高准确度的数据。                                        钟紊乱所致的疾病的发生、发展，因此蛋白激酶是小分
        2.2  靶向筛选法                                          子药物研发中备受关注的调控靶点。靶向蛋白激酶的
            X 射线晶体学的发展对蛋白晶体结构的解析起到                          生物钟调控小分子化合物见表1。
        了巨大的推动作用，而对钟蛋白结构的认识又使得筛选                                蛋白激酶CK1在钟基因的调控中发挥着重要作用，
        靶向特定蛋白的小分子化合物成为可能 。                                 PER蛋白是其主要作用靶点 。小分子化合物Longday-
                                                                                    [11]
                                          [15]
            该方法可有针对性地寻找作用于目的蛋白的小分                           sin 是最先被鉴定出的 CK1 抑制剂，具有延长周期的作
        子化合物，避免了无偏差筛选的盲目性和偶然性，保证                            用 。虚拟分子对接研究显示，Longdaysin 的嘌呤环和
                                                              [16]
        了筛选出的活性小分子能直接作用于调节生物钟的核                             亚胺基与 CK1 亮氨酸残基间形成氢键，介导两者结合；
        心蛋白，而不是通过其他途径间接影响生物钟的节律。                            抑制 CK1 活性将导致 PER 磷酸化减弱，并使 PER-CRY
        这些优点使靶向筛选法对于筛选鉴定调节生物钟的小                             复合物对 CLOCK-BMAL1 异二聚体的抑制作用减弱，

                                  表1 靶向蛋白激酶生物钟的调控小分子化合物（部分）
         项目   Longdaysin  NCC007  IC261   PF-4800567  PF-670462  DMAT  CX-4945    GO289     CHIR99021
         作用靶点 CK1      CK1        CK1     CK1       CK1     CK2       CK2         CK2       GSK-3
         结构式







         作用   CK1α/δ抑制剂 CK1α/δ抑制剂  CK1抑制剂  CK1ε 抑制剂  CK1δ抑制剂  CK2抑制剂  CK2抑制剂      CK2抑制剂    GSK-3α/β抑制剂
         表型影响 延长周期     延长周期       延长周期    延长周期      延长周期    延长周期      延长周期        延长周期      缩短周期
         应用领域 睡眠障碍     睡眠障碍       睡眠障碍    －         －       －         －           癌症        代谢障碍
            注：“－”表示无相关内容


        ·892 ·  China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 7                                    中国药房    2021年第32卷第7期
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