Page 50 - 《中国药房》2021年第6期
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食量、饮水量，观察其毛发变化。实验第5天给药前（即                           2.5.3  样本 DNA 测序质量评估及肠道菌群的 Alpha 多
        造模期结束后），收集空白对照组和模型组大鼠的新鲜                            样性分析      使用 R 2.15.3 软件绘制稀释曲线、等级聚类
        粪便 4～5 粒于无菌 EP 管中，观察并记录粪便颜色和形                       曲线、物种累积箱形图和分组OTUs韦恩图，以评价测序
        态后将其置于－80 ℃冰箱中冻存，备用（因各造模组的                          的深度、物种丰富度、样本量是否足够以及各组OTUs组
        造模方式相同，故仅对模型组和空白对照组的结果进行                            成情况。使用Qiime 1.9.1软件进行样本的Alpha多样性
        比较，以评价造模效果）。实验第11天给药结束后（即恢                          分析，计算香农指数（Shannon 指数）、Chao1 指数、ACE
        复期结束后），收集 5 组大鼠的新鲜粪便 4～5 粒于无菌                       指数和样品文库覆盖率（Goods coverage）。其中，Shan-
        EP管中，观察并记录粪便颜色和形态后将其置于－80 ℃                         non指数反映样品中微生物的多样性，其值越大，说明菌
        冰箱中冻存，备用。参考文献[7]方法对粪便形态进行分                          群多样性越高；Chao1 和 ACE 指数反映群落中 OTUs 的
        级：0级为褐色、成形、硬粪便；1级为黄色或褐色、成形、                         数目，是生态学中估计物种总数的常用指数，其值越大，
        软粪便；2级为黄色或褐色、稀烂、不成形粪便。                              说明菌群丰富度越高；Goods coverage 反映测序结果是
        2.3 大鼠肠道菌群基因组DNA提取与PCR扩增                            否可代表样本中微生物的真实情况，其值越大（最大值
                                                                                               [9]
            根据磁珠法土壤和粪便基因组DNA提取试剂盒说                          为1），说明样本中序列被测出的概率越高 。
        明书方法提取粪便样本中肠道菌群的基因组DNA，利用                           2.5.4  肠道菌群的 Beta 多样性分析          用 Qiime 1.9.1 软
        琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 的纯度和浓度后，用无菌水                          件 计 算 Unifrac 距 离 、构 建 UPGMA（Unweighted pair-
        稀释 DNA 至 1 ng/µL。以稀释后的 DNA 为模板进行                    group method with arithmetic mean）样本聚类树，使用
        PCR 扩 增 。 16S V4 区 引 物 序 列 为 515F：5′-GTGC-          R 2.15.3软件绘制无度量多维标定（Non-metric multi-di-
        CAGCMGCCGCGGTAA-3′；806R：5′-GGACTACHVG-              mensional scaling，NMDS）图 。
                                                                                    [10]
        GGTWTCTAAT-3′。 反 应 体 系 含 Phusion Master Mix         2.6  统计学方法
        （2×）15 µL，上、下游引物（2 µmol/L）各 3 µL，DNA 模板                 采用SPSS 20.0软件对数据进行统计分析。计量资
        （1 ng/µL）10 µL，无菌水 2 µL。扩增条件为98 ℃预变性                料以 x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间
        1 min；98 ℃变性10 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共            两两比较采用LSD检验。P＜0.05表示差异具有统计学
        30 个循环；再以 72 ℃延伸 5 min 结束反应。使用 2％琼                  意义。
        脂糖胶电泳（电压 80 V、电泳时间 40 min）纯化 PCR 产                  3 结果
        物。使用 GeneJET 胶回收试剂盒割胶回收主带大小在                        3.1  造模情况
        400～450 bp 之间的目标条带。上述 DNA 提取与 PCR                   3.1.1  造模期大鼠的一般情况观察结果               造模期内，各
        扩增均由北京诺禾致源生物信息有限公司完成。                               组大鼠均较活泼、反应敏捷，毛发光亮，饮食正常。但从
        2.4  大鼠肠道菌群基因组文库构建与高通量测序                            实验第3天起，模型组大鼠开始出现1级成形、软粪便和
            根据 TruSeq DNA PCR-Free Library Preparation Kit  2级稀烂、不成形粪便，而空白对照组大鼠的粪便在整个
        建库试剂盒方法进行文库的构建，将构建好的文库经过                            实验期内均为0级硬粪便。空白对照组和模型组大鼠体
        Qubit定量和文库检测。Qubit数值≥30者，使用测序系                      质量的增长值分别为（13.50±2.59）、（13.00±5.02）g，二
        统进行测序。上述文库构建与高通量测序均由北京诺                             者比较差异无统计学意义（P＞0.05）。
        禾致源生物信息有限公司完成。                                      3.1.2  造模期粪便样本DNA测序质量评估及肠道菌群
        2.5  大鼠肠道菌群基因组测序数据处理与分析                             的 Alpha 多样性分析结果         稀释曲线结果显示，当序列
        2.5.1  原始数据处理         因测序得到的原始数据（Raw                接近60 000时，再增加序列数量后很少产生新的OTUs，
                                                                                [11]
        tags）中还存在一定比例的干扰数据，为了使信息分析的                         表明试验测序深度足够 。等级聚类曲线结果显示，从
        结果更加准确、可靠，首先将Raw tags从碱基数达到3的                       水平方向看，空白对照组在横轴上物种等级的跨度显著
        第1个低质量碱基位点截断，进一步过滤掉其中连续高                            大于模型组，表明空白对照组大鼠肠道菌群的丰富度高
        质量碱基长度小于tags长度75％的数据，再与物种注释                         于模型组。物种累积箱形图结果显示，当样本数量不断
        数据库（https：//github.com/torognes/vsearch/）进行比对，      增加至空白对照组和模型组样本量之和时，很少有新的
        检测并去除嵌合体序列，从而得到最终的有效数据（Ef-                          物种出现，表明样本数量足够 。通过空白对照组和模
                                                                                      [12]
        fective tags）。                                      型组样本聚类得到的分组OTUs韦恩图看，两组样本（12
        2.5.2  可操作分类单元聚类和物种注释                 利用 Uparse     份）有 580 个共有的 OTUs，其中空白对照组有 112 个特
        v7.0.1001软件对所有样本的全部有效数据进行聚类，以                       征OTUs，而模型组只有63个特征OTUs，表明空白对照
        97％ 的 一 致 性 将 序 列 聚 类 成 为 可 操 作 分 类 单 元             组大鼠肠道菌群的物种丰富度高于模型组。造模期
        （OTUs），以 OTUs 中出现频数最高的序列作为代表对                       DNA 测序质量评估及肠道菌群的 Alpha 多样性分析结
        OTUs进行物种注释 。根据物种注释结果，分别统计在                          果见图1。
                          [8]
        门、属水平丰度排名前10的物种。                                        模型组大鼠 Shannon 指数显著低于空白对照组


        ·684 ·  China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 6                                    中国药房    2021年第32卷第6期
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