Page 83 - 《中国药房》2021年第4期
P. 83
州第二人民医院制备，阿莫西林克拉维酸钾（14 ∶ 1）干混 下各质量浓度的受试药液，按180 μL/孔加入至经消毒处
悬剂[批号190315，规格600 mg（阿莫西林）∶ 42.9 mg（克 理过的 96 孔板中（每质量浓度设置 3 个复孔），随后按
拉维酸）]购自上海海虹实业（集团）巢湖今辰药业有限 20 μL/孔加入“2.1”项下菌悬液。同时，设置阳性对照孔
公司，大鼠白细胞介素1β（IL-1β）、IL-6、IL-10、肿瘤坏死 （只加入菌悬液20 μL）、阴性对照孔（只加入MH肉汤20
因子α（TNF-α）、羟脯氨酸（HYP）、胶原蛋白Ⅰ（Col Ⅰ）、 μL）、空白对照孔（只加入无菌生理盐水20 μL），各设置3
Col Ⅲ酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（批号 ZC- 个复孔。将 96 孔板置于 37 ℃培养箱中培养 18 h 后取
36391、ZC-36404、ZC-36379、ZC-37624、ZC-37113、ZC- 出，以肉眼和显微镜观察，并以显微镜下无明显细菌生
36122、ZC-36009）均购自上海茁彩生物科技有限公司， 长的孔所对应的药液质量浓度为 MIC。取肉眼观察无
兔 TLR2 单克隆抗体、兔 TLR4 多克隆抗体、兔磷酸 细菌生长的菌液各 0.1 mL 移种至不含药物的牛肉膏蛋
化-NF-κB p65（p-NF-κB p65）多克隆抗体、生物素化山羊 白胨琼脂培养基上，于 37 ℃培养箱中培养 18 h，以培养
抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗均购自艾博抗（上海）贸易 基中菌落计数少于 5 个的孔对应的药液质量浓度作为
有限公司，兔β-肌动蛋白（β-actin）单克隆抗体购自武汉 MBC。
爱博泰克生物科技有限公司，ECL 发光试剂盒（批号 2.4 分组与造模
KF001）购自安诺伦（北京）生物科技有限公司，5×十二 将 50 只大鼠随机分成 5 组，即模型组、阳性对照组
烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）蛋白上 （阿莫西林克拉维酸钾，以阿莫西林计 120 mg/kg，按每
样缓冲液（批号 AR1112-10）购自博士德生物工程有限 日成人临床常用剂量换算）和愈疡胶囊高、中、低剂量组
公司；20×TBST 缓冲液（批号 28360）购自赛默飞世尔科 （以 1 倍 MIC 换算剂量作为中剂量，以 2 倍中剂量和 1/2
技（中国）有限公司；MH肉汤购自广州环凯微生物科技 中剂量分别作为高、低剂量），每组 10 只。造模前 24 h，
有限公司，牛肉膏蛋白胨琼脂培养基购自杭州微生物试 用8％硫化钠溶液脱去大鼠背部被毛；造模时，各组大鼠
剂有限公司，苏木精染液和伊红染液均购自武汉赛维尔 腹腔注射 3％戊巴比妥钠溶液（20 mL/kg）进行麻醉，将
生物技术有限公司；其余试剂均为分析纯或实验室常用 20 g 砝码烧红，冷却 10 s 后贴于大鼠背部，烫伤 10 s，伤
6
规格，水为超纯水。 处涂抹金黄色葡萄球菌溶液（浓度为 1×10 CFU/mL，溶
1.3 动物 剂为生理盐水）1 mL，待其自然均匀分布，以患处出现大
SPF 级 SD 大鼠，雌雄各半，体质量（230±20）g，由 量黄、白色脓液，溃疡，红肿为细菌感染性皮炎模型复制
成都达硕实验动物有限公司提供，动物生产许可证号为 成功标志。
SCXK（川）2020-030。 2.5 药物干预
1.4 菌株 造模成功 24 h 后，模型组大鼠灌胃等体积生理盐
金黄色葡萄球菌购自中国普通微生物菌种保藏管 水，各干预组大鼠灌胃对应药物（20 mL/kg），每日 1 次，
理中心。 连续7 d。末次给药后，同“2.4”项下方法麻醉后，处死大
2 方法 鼠，收集伤处皮肤组织，部分组织于－80 ℃下保存，剩余
2.1 菌悬液的制备 组织在 4％多聚甲醛-2％戊二醛固定液中固定，分别用
在净化工作台中，将金黄色葡萄球菌接种到牛肉膏 于相关指标检测、表征和形态学观察。
蛋白胨琼脂培养基上，于37 ℃、5％CO2培养箱中倒置培 2.6 大鼠皮肤组织表征观察
养18 h进行复苏。取出复苏后的细菌，挑选单个菌落至 观察各组大鼠给药第 1、3、5、7 天时的一般体征和
MH 肉汤中，于 37 ℃、150 r/min 条件下培养 12 h。取上 积脓、红肿、溃疡等表现，肉眼观察伤口结痂、脱痂和愈
8
述细菌适量，使用无菌生理盐水制成1.5×10 CFU/mL的 合等情况，同时利用描绘创面的透明硫酸纸面积计算创
6
菌悬液，再用 MH 肉汤稀释至 1×10 CFU/mL，并于 30 面愈合率：创面愈合率（％）＝（原始创面面积－未愈合
min内完成后续接种。 创面面积）/原始创面面积。
2.2 受试药液的制备 2.7 大鼠皮肤组织中炎症因子和纤维蛋白含量测定
取愈疡胶囊微粉 10 g，溶于无菌生理盐水 100 mL 取冻存的皮肤组织适量，按照ELISA试剂盒说明书
中，制成质量浓度为100 mg/mL的药液，作为最大浓度； 操作，使用酶标仪于 450 nm 波长处测定光密度（OD）值
再用无菌生理盐水倍比稀释成50.00、25.00、12.50、6.25、 并计算各组大鼠皮肤组织中 IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α、
3.12、1.56、0.78、0.39 mg/mL的药液，备用。 HYP、Col Ⅰ、Col Ⅲ的含量。
2.3 最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）的 2.8 大鼠皮肤组织形态学观察
测定 参考文献[9]方法，取固定好的皮肤组织适量，经包
参照文献[8]采用肉汤稀释法进行测定。取“2.2”项 埋后切片，使用苏木精-伊红（HE）染料进行染色，在数码
中国药房 2021年第32卷第4期 China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 4 ·461 ·
