Page 69 - 《中国药房》2021年2期
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公 司 ；5％ 2，4，6- 三 硝 基 苯 磺 酸 溶 液（TNBS，批 号            mL（以 0.9％氯化钠注射液为溶剂，含双歧杆菌活菌
        2508-19-2）购自南宁市托普邦生物科技有限公司；Trans                   0.35 g），安肠汤组大鼠按比例灌胃低、中、高剂量安肠汤
        Script -Uni 一步 gDNA 拆卸和 cDNA 合成超混合液（批              溶液 1、5、10 mL，每 mL 约相当于生药总量 0.11 g（各药
             ®
        号N20909）购自北京全式金生物科技有限公司；兔甘油                        物组用药剂量均参照前期试验 并按人与动物体质量系
                                                                                      [1]
        醛 -3- 磷 酸 脱 氢 酶（GAPDH）多 克 隆 抗 体（ 批 号               数换算而得），每日1次，连续给药14 d。
        AB-P-R001）购自南宁市托普邦生物科技有限公司；大鼠                      2.2 标本采集与处理
        免疫球蛋白 G（IgG）二抗（批号 SLBP0889V）、完全弗式                      末次给药后，所有大鼠均禁食不禁水 24 h，腹腔注
        佐剂（批号 20170301）均购自上海希格玛高技术有限公                      射10％水合氯醛溶液进行麻醉后，立即剖腹取腹主动脉
        司；超敏型化学发光（ECL）试剂（批号 BL523A）购自合                     血约 8 mL，静置 30 min，以 3 000 r/min 离心 15 min 分离
        肥兰杰柯科技有限公司；0.9％氯化钠注射液（批号                           上层血清，置于－20 ℃冰箱内保存，待测。统一在距大
        H20033974，规格500 mL；作生理盐水用）购自贵州科伦                   鼠肛门约 7 cm 处取结肠组织后并置于 4％多聚甲醛溶
        药业有限公司；小鼠抗大鼠TLR4一抗（批号J1016）购自                      液中密封，置于 4 ℃下避光保存，待测。取肠道内粪便
        美国 Santa Cruz 公司；兔抗大鼠 NF-κB p65 一抗（批号              样品适量，置于－20 ℃冰箱中保持，待测。
        8242S）购自美国CST公司；兔抗小鼠TRAF6 一抗（批号                    2.3 指标检测
        ab40675）购自美国Abcam公司；大鼠IL-6酶联免疫吸附
                                                           2.3.1  大鼠结肠组织病理情况观察                取“2.2”项下经
        测定（ELISA）分析试剂盒（批号 JYM0651Ra）、大鼠 FC
                                                           4％多聚甲醛溶液固定后的大鼠结肠组织适量，依次进
        ELISA 分析试剂盒（批号 JYM1159Ra）均购自武汉基因
                                                           行石蜡包埋、切片（厚度10 μm）、脱蜡、苏木精染液染色、
        美生物科技有限公司；大鼠 TNF-α ELISA 分析试剂盒
                                                           冲洗、分化液分化、伊红染液染色、脱水透明封片等处
       （批号E-EL-R2856c）购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有
                                                           理，在显微镜下观测组织形态学改变并拍照。
        限公司，辣根过氧化酶标记的兔二抗（批号 7074、7076）
                                                           2.3.2  各组大鼠结肠组织中TLR4、TRAF6、NF-κB蛋白
        购自美国Cell Signaling Technology公司；其余试剂均为
                                                           表达水平检测         采用 Western blotting 法。取“2.2”项下
        实验室常用规格。
                                                           各组大鼠结肠组织40 mg，放入2 mL离心管，按照RIPA
        1.3  动物
                                                           裂解液说明书方法提取相关蛋白，匀浆至无沉淀，以
            健康 SPF 级 SD 成年大鼠 90 只，2 月龄，雄雌各半，
                                                           12 000 r/min离心5 min，取上清液采用BCA法测定蛋白
        体质量（250±20）g，购自长沙天勤生物技术有限公司，
                                                           含量并定量至2 μg/μL。蛋白于100 ℃变性10 min，取变
        动物生产许可证号的 SCXK（湘）2014-0011。动物由广
                                                           性后的蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳
        西中医药大学医学分子实验室进行专人饲养，饲养条件
                                                           （SDS-PAGE）分离后，转至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，
        为安静、通风、清洁、昼夜室温 20～23 ℃、相对湿度
                                                           用 8％脱脂奶粉室温封闭 3 h。加入相应一抗[TLR4（稀
        50％～60％。本实验方案经广西中医药大学第一附属
                                                           释度为1∶2 000）、TRAF6（稀释度为1∶2 000）、NF-κB（稀
        医院动物实验伦理委员会批准，批准号为 2013（KF）-E-
        003。                                               释度为1 ∶ 2 000）、GAPDH（稀释度为1 ∶ 2 000）]，37 ℃孵
        2 方法                                               育 12 h；以 TBST 洗膜 15 min×3 次，加入 IgG 二抗（稀释
        2.1  分组、造模与给药                                      度为 1 ∶ 4 000），37 ℃ 孵育 1 h，以 TBST 洗膜 15 min×3
            大鼠适应性喂养1周后，将其随机分为空白组、模型                        次。以 ECL 显色后，于凝胶成像仪中进行曝光成像后，
        组、阳性对照组和安肠汤低、中、高剂量组，每组 15 只。                       采用 Image J 1.51 软件对蛋白条带灰度值进行分析，以
        参照文献方法（TNBS 结合乙醇复合灌肠法） 建立 UC                       目的蛋白条带灰度值与内参GAPDH蛋白条带灰度值的
                                               [8]
        大鼠模型：所有大鼠禁食不禁水 24 h 后，均腹腔注射                        比值表示目的蛋白的表达水平。
        10％水合氯醛溶液（0.003 mL/g）进行麻醉，顺着大鼠肛                    2.3.3  各 组 大 鼠 结 肠 组 织 中 TLR4、TRAF6、TNF-α 、
        门-直肠生理弯曲插入软管约 7 cm，注入 TNBS/乙醇                      NF-κ B mRNA 水 平 检 测      采 用 实 时 荧 光 定 量 PCR
       （TNBS+等体积 50％乙醇，100 mg/kg，以 TNBS 计）造                （RT-PCR）法。取“2.2”项下各组大鼠结肠组织适量，剪
        模，再将大鼠倒立保持 2 min 以保证药液充分吸收。造                       碎后放入2 mL离心管，加入 Triquick Reagent总RNA提
        模成功标准 ：（1）大鼠反复大便溏泄甚至带有脓血；（2）                       取试剂 1 mL，匀浆至无沉淀，静置 5 min 后加入氯仿 0.2
                  [8]
        大鼠食欲及体质量均下降；（3）大鼠精神萎靡、毛色枯                          mL，振荡15 s；于4 ℃下以4 500 r/min离心15 min后，取
        槁、畏寒弓背，群体聚堆；具备两项及以上者认定为造模                          上清液 0.5 mL 加至另一 1.5 mL 离心管中；加入异丙醇
        成功。空白组大鼠除注入生理盐水外，其余操作同前。                           0.5 mL，置于室温下静置 10 min；重复上述步骤 3 次，弃
        大鼠麻醉清醒后，可自由进饮进食。                                   上清液。沉淀于 65 ℃金属浴锅中烘干，加入焦碳酸二
            造模成功 2 d 后，空白组和模型组大鼠灌胃生理盐                      乙酯（DEPC）水0.03 mL溶解，经超微量核酸检测仪测定
        水5 mL，阳性对照组大鼠灌胃双歧杆菌活菌胶囊悬液5                         RNA 浓度并按反转录试剂盒说明书进行操作，将所得


        中国药房    2021年第32卷第2期                                               China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 2  ·191 ·
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