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分析或 t 检验；P＜0.05 为差异有统计学意义。结果，与 正常组样品
60 000 模型组样品
正常组小鼠比较，模型组小鼠WBC、NE、LY、MO计数均 QC样品
40 000
显著减少（P＜0.01）；与模型组比较，药物组小鼠上述血 20 000
常规指标均显著增加（P＜0.01），详见表1。 t[2] 0
表 1 各组小鼠血常规指标水平比较（x±±s，n＝8，×10 9 －20 000
－40 000
－1
L ） －60 000
Tab 1 Comparison of routine blood indexes of mice in －80 000 －50 000 0 50 000 100 000
－150 000
－1
each group（x±±s，n＝8，×10 L ） t[1]
9
图 1 正常组、模型组小鼠血清样品和 QC 样品的 PLS-
组别 WBC计数 NE计数 LY计数 MO计数
正常组 9.71±0.46 4.88±0.50 3.41±0.41 1.14±0.14 DA得分图
模型组 5.97±0.82 ＊＊ 2.32±0.20 ＊＊ 2.70±0.44 ＊＊ 0.30±0.03 ＊＊ Fig 1 PLS-DA score plot of serum samples and QC
药物组 11.44±1.52 ## 4.70±0.42 ## 3.96±0.25 ## 2.46±0.36 ##
samples in normal group and model group
##
＊＊
注：与正常组比较， P＜0.01；与模型组比较，P＜0.01
##
＊＊
Note：vs. normal group， P＜0.01；vs. model group，P＜0.01 常组和模型组小鼠血清代谢物有所不同。基于此，本研
2.4 小鼠血清样品LC-MS分析 究进一步采用多元统计分析技术对正常组和模型组之
2.4.1 血清样品的处理 取“2.2”项下冻存的血清样品 间的差异进行分析。
适量，解冻后，精密吸取100 μL，置于EP管中，依次加入 100
甲醇 225 μL、乙腈 75 μL 以沉淀蛋白，涡旋 2 min 后，于 ％ 80
4 ℃下以13 000 r/min离心15 min后，取上清液，待测。 相对丰度， 60
40
2.4.2 质控（QC）样品的制备 分别取“2.4.1”项下制备 20
的所有待测血清样品各10 μL，混合，即得QC样品。 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32
2.4.3 LC-MS 条件 色谱柱：Waters ACQUITY UPLC 时间，min
A.正常组
HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流动相：0.1％甲酸水
100
溶液（A）-0.1％甲酸乙腈溶液（B），梯度洗脱（0～2 min， 80
％
98％A；2～3 min，98％A→65％A；3～15 min，65％A→ 60
30％A；15～18 min，30％A；18～29 min，30％A→2％A； 相对丰度， 40
29～31 min，2％A；31～33 min，2％A→98％A；33～35 20
0
min，98％A）；柱温：40 ℃；流速：0.2 mL/min；进样量：5 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32
时间，min
μL。离子源：电喷雾离子源（ESI）；采用正、负离子切换 B.模型组
采集模式和 Full Scan/dd-MS 扫描模式；正、负极电压： 图2 小鼠血清中代谢物的TIC图（正离子模式）
2
3 500 V；毛细管温度：320 ℃；鞘气流速：35 Arb；辅气流 Fig 2 TIC chromatograms of metabolites in the
速：10 arb；扫描范围：m/z 100～1 500。 serum of mice（positive ion mode）
2.4.4 LC-MS 检测系统的稳定性分析 在进行小鼠血 100
清样品LC-MS代谢组学分析的过程中，各血清样品每分 ％ 80
析 6 次，需随机检测 QC 样品 1 次以监测 LC-MS 检测系 相对丰度， 60
40
统的稳定性。本研究随机选择6只小鼠（下同）的原始检 20
测数据（即色谱峰峰面积，下同）进行分析：将LC-MS原 0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32
始数据的“Raw”格式文件导入 Compound Discover 3.0 时间，min
A.正常组
软件中进行提取和预处理，再将所得数据用 Excel 2010
100
软件进行面积归一化处理后，通过 Simca-P 13.0 软件进 80
行偏最小二乘法-判别分析（PLS-DA），其得分图见图 ％ 60
1。由图 1 可见，正常组、模型组小鼠血清样品和 QC 样 相对丰度， 40
品均分别聚在一起，提示该LC-MS代谢组学检测系统的 20
0
稳定性良好 。 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32
[18]
时间，min
2.4.5 代谢物分析 采用“2.4.3”项下 LC-MS 条件，于 B.模型组
正、负离子模式下采集正常组和模型组小鼠血清样品的 图3 小鼠血清中代谢物的TIC图（负离子模式）
总离子流图（TIC），详见图2、图3。结果显示，代谢物在 Fig 3 TIC chromatograms of metabolites in the
较短时间内可被很好地分离，且在正、负离子模式下，正 serum of mice（negative ion mode）

中国药房 2020年第31卷第21期 China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 21 ·2629 ·