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阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一种以              有限公司，批号：bs-0107p）；胎牛血清（美国 BI 公司，批
        进行性认知功能障碍为主要临床表现的神经退行性疾                             号：04-007-1A）；RPMI 培养基（美国 HyClone 公司，批
        病 。AD 患者的主要病理特征为β淀粉样蛋白（β-amy-                       号：SH30809.01）；LY294002对照品（美国AbMole公司，
          [1]
        loid protein，Aβ）沉积形成的老年斑、Tau 蛋白过度磷酸                 批 号 ：15447-36-6，纯 度 ：100％）；胰 蛋 白 酶（批 号 ：
        化引起的神经原纤维缠结（Neurofibrillarytangles，NFTs）            TB150）、青链霉素混合液（100×，批号：P1400）、MTT 试
                       [2]
        和神经细胞缺失 。已有研究显示，向大鼠脑内注射Aβ                           剂（批号：M8180）、脱脂奶粉（批号：D8340）均购自北京
        后，可引起其记忆障碍及神经损伤；此外，AD 患者大脑                          索 莱 宝 科 技 有 限 公 司 ；RIPA 细 胞 裂 解 液（批 号 ：
        中也存在Aβ异常沉积和大量的神经细胞损伤，提示Aβ                           P0013B）、PMSF 蛋白酶抑制剂（100×，批号：P1005）、
        诱导的神经细胞损伤可能为 AD 发生的重要原因                      [3-4] 。  BCA 蛋白浓度试剂盒（100×，批号：P0010S）、十二烷基
        研究表明，Aβ的主要成分Aβ 1-42具有神经毒性作用，可致                      硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）蛋白上样缓
        神经细胞损伤，从而引发神经系统发生退行性病变                     [4-5] 。  冲液（5×，批号：P00151）、特超敏 ECL 化学发光试剂盒
            磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶 B（PI3K/Akt）信号转                 （批号：P0018AS）均购自上海碧云天生物技术有限公
        导通路是调控神经细胞分化、存活、凋亡的通路之一，也                           司；磷酸酶抑制剂（100×，北京康为世纪生物科技有限公
        是调节受损神经细胞修复、促进神经细胞存活的重要信                            司，批号：CW2383S）；Tween-20、SDS、过硫酸铵（APS）、
               [6]
        号通路 。LY294002 是一种能够阻断上述信号传导的                        四甲基乙二胺（TEMED）、甘氨酸、二甲基亚砜（DMSO）
        蛋白激酶抑制剂，可对细胞中的 PI3K 信号通路发挥特                         均购自美国 Sigma 公司；预染蛋白标志物（加拿大 Fer-
        异性抑制作用，并可抑制PI3K/Akt信号途径，如抑制Akt                      mentas 公司，批号：26616）；小鼠 PI3K 单克隆抗体（批
                                                 [7]
        磷酸化等，从而对下游靶蛋白的表达进行调节 。糖原                            号 ：60225-1-Ig）、小 鼠 Akt 单 克 隆 抗 体（ 批 号 ：
        合成激酶 3β（GSK3β）是 Akt 的重要底物，其活性受 Akt                  60203-2-Ig）、兔 GSK3β多克隆抗体（批号：15113-1-AP）
        的负调节，并与Tau蛋白的过度磷酸化密切相关，同时Aβ                         均购自武汉三鹰生物技术有限公司；兔p-PI3K单克隆抗
        的生成和沉积亦能导致 Tau 蛋白的过度磷酸化                   [8-9] 。已  体（批号：4228）、兔 p-Akt 单克隆抗体（批号：4060）、兔
        有研究显示，Aβ的神经毒性与 PI3K/Akt/GSK3β信号通                    p-GSK3β 单克隆抗体（批号：9323）购自美国 CST 公司；
        路相关    [10-11] ，因此找到可调节PI3K/Akt/GSK3β信号通路           小鼠β-actin 单克隆抗体（批号：TA-09）、辣根过氧化物
        相关位点的靶向药物以对抗 Aβ的神经毒性，可能成为                          （HRP）标记的山羊抗兔 IgG 二抗（批号：122826）、HRP
        防治 AD 的有效方法之一。研究发现，芥子酸（Sinapic                      标记的山羊抗小鼠IgG 二抗（批号：122011）均购自北京
        acid，SA）可减轻Aβ 1-42诱导的小鼠海马体CA1区神经细                   中杉金桥生物技术有限公司；其余试剂均为分析纯，水
        胞的损伤，使红藻氨酸引起的小鼠海马体神经细胞损伤                            为超纯水。
        得到改善，并能够显著减轻链脲佐菌素诱导的大鼠记忆                            1.3  细胞
        缺陷并抑制神经细胞变性，且呈一定的剂量依赖性                      [12-13] 。   大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤细胞PC12由中国科学
        基于此，本研究以 Aβ 1-42诱导大鼠 PC12 细胞制备 AD 细                 院上海细胞生物研究所提供。
        胞病理模型，并以 LY294002 为参照，探讨 SA 的神经细                    2 方法
        胞保护作用及该作用与 PI3K/Akt/GSK3β信号通路的潜                     2.1  细胞培养
        在关系，以期为临床治疗AD提供新的思路。                                    将 PC12 细胞接种于含 10％胎牛血清、100 U/mL 青
        1 材料                                                霉素和 100 μg/mL 链霉素的 RPMI 培养基中，并置于
        1.1  仪器                                             37 ℃、5％CO2培养箱中培养（培养条件下同），每 2～3 d
            Series 8000 型 CO2培养箱（美国 Thermo Fisher Sci-      换液1次。
        entific公司）；DL-CJ-2NDII型AIRTECH-超净工作台（北              2.2 分组
        京东联科技有限公司）；M200 PRO 型多功能酶标仪（瑞                           根据课题组前期 MTT 试验结果，确定 Aβ 1-42 的最
        士 Tecan 公司）；CKX41-A32PH 型倒置显微镜（日本                   适浓度为 2 μmol/L，SA 的浓度为 100 μmol/L；根据文
        Olympus公司）；5804R型离心机（德国Eppendorf公司）；                献报道，处理神经细胞时，LY294002 的最适浓度为
        165-8001型电泳仪、1703811型电转仪、Gel Doc XR型凝               10 μmol/L 。将细胞随机分为对照组、Aβ 组（Aβ 1-42 2
                                                                     [14]
        胶成像系统（美国Bio-Rad公司）；S11-6-S型恒温水浴锅                    μmol/L）、Aβ+SA 组（Aβ 1-42 2 μmol/L+SA 100 μmol/L）、
        （上海跃进医疗器械有限公司）；LDZH-200KBS 型高压                      A β + SA + LY 组（A β 1-42 2 μ mol/L + SA 100 μ mol/L +
        蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）。                                   LY294002 10 μ mol/L）、A β + LY 组（A β 1-42 2 μ mol/L +
        1.2  药品与试剂                                          LY294002 10 μmol/L）、LY 组（LY294002 10 μmol/L）。
            SA 对照品（上海源叶生物科技有限公司，批号：                         2.3 PC12细胞的形态观察和存活率检测
        S30697，纯度：≥97％）；Aβ1-42蛋白（北京博奥森生物技术                      采用倒置显微镜观察并采用MTT法检测。收集对


        ·2520 ·  China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 20                                 中国药房    2020年第31卷第20期
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