Page 95 - 2020年20期

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数生长期的PC12细胞按5×10 个/mL接种至96孔板中， 变弱，Aβ+LY组细胞碎片较多；LY组细胞与对照组比较
每孔 100 mL，按照“2.2”项下方法分组，每组设置 6 个复 无明显差异，详见图1。
孔。继续培养 24 h 后，Aβ+SA+LY 组、Aβ+LY 组、LY 组
先加入 LY294002 10 μmol/L 孵育 1 h；除对照组和 LY 组
外，其余4组分别加入Aβ1-42 2 μmol/L处理24 h以复制损
伤细胞模型；随后，Aβ+SA 组和 Aβ+SA+LY 组加入 SA
100 μmol/L，继续培养24 h，置于倒置显微镜观察其形态
并拍照。每孔加入 MTT 溶液（5 mg/mL）10 μL，继续培
养 4 h，小心吸去孔内培养液，每孔加入 DMSO 150 μL， A. 对照组 B. Aβ组
低速振荡10 min，以酶标仪于570 nm波长处检测吸光度
（OD）值，并按如下公式计算细胞存活率：细胞存活率
（％）＝样品组OD均值/对照组OD均值×100％。上述试
验重复3次。
2.4 PC12 中细胞 PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、GSK3β、
p-GSK3β蛋白表达水平的检测 C. Aβ+SA组 D. Aβ+SA+LY组
采用 Western blotting 法检测。收集对数生长期的
P12细胞，按“2.3”项下方法分组、造模、给药。培养24 h
后，以2 000 r/min离心10 min收集细胞，加入含胰蛋白酶、
磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液，于冰上裂解后，以12 000
r/min 离心 20 min，收集上清液即得细胞总蛋白；采用
BCA 法测定总蛋白含量，于水浴中煮沸 5 min 制备所需 E. Aβ+LY组 F. LY组
的变性蛋白样品；采用 10％SDS-PAGE 进行恒流电泳 图1 各组PC12细胞的倒置显微图（×200）
（电流：60 mA），在恒压电（电压：75 V，时间：2 h）以湿转 Fig 1 Inverted micrographs of PC12 cells in each
法转膜，于 37 ℃下以 5％脱脂奶粉封闭 1 h，加入 PI3K、 group（×200）
Akt、GSK3 β 一 抗（稀 释 比 例 均 为 1 ∶ 800）和 p-PI3K、 3.2 各组细胞的存活情况
p-Akt、p-GSK3β一抗（稀释比例均为1∶600），于4 ℃孵育 与对照组比较，Aβ 组细胞的存活率显著降低（P＜
过夜；采用三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（TBST）溶液清洗3 0.01）；与 Aβ 组比较，Aβ+SA 组细胞的存活率显著升高
次，每次 5 min，加入二抗（稀释比例均为 1 ∶ 1 000；HRP （P＜0.05）；与Aβ+SA 组比较，Aβ+SA+LY组细胞的存活
标记的山羊抗兔 IgG 二抗对应 GSK3β、p-PI3K、p-Akt、 率显著降低（P＜0.05），而 Aβ+LY 组细胞的存活率虽有
p-GSK3β抗体，HRP 标记的山羊抗小鼠 IgG 二抗对应 下降，但组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）；同时，
PI3K、Akt、β-actin抗体），于 37 ℃下反应 1 h，用TBST溶 单独给予 LY294002 对 PC12 细胞的存活率无显著影响
液清洗 3 次，每次 5 min；以 ECL 显色后，使用凝胶成像 （P＞0.05），详见表1。
系统曝光成像，采用 Image Lab 4.0.1 图像分析软件检测 表1 各组PC12细胞的存活率（x±±s，n＝3，，％％）
蛋白条带灰度值，以目的蛋白与内参蛋白（β-actin）条带 Tab 1 Cell viabilities of PC12 cells in each group（x±±
灰度值的比值来表示其相对表达量，并以p-PI3K/PI3K、 s，n＝3，，％％）
p-Akt/Akt、p-GSK3 β/GSK3 β 的 比 值 表 示 PI3K、Akt、 组别 存活率 组别 存活率
GSK3β蛋白的磷酸化水平。上述试验重复3次。 对照组 100.00±6.40 Aβ+SA+LY组 88.07±4.37 Δ
2.5 统计学方法 Aβ组 86.67±5.19 ＊＊ Aβ+LY组 90.28±4.72
Aβ+SA组 93.95±3.15 # LY组 101.14±6.89
采用SPSS 22.0软件对数据进行统计分析。计量资
#
＊＊
注：与对照组比较， P＜0.01；与 Aβ组比较，P＜0.05；与 Aβ+SA
料以x±s表示，组间比较采用t检验。以P＜0.05为差异
组比较，P＜0.05
Δ
有统计学意义。 Note：vs. control group， P＜0.01；vs. Aβ group，P＜0.05；vs.
＊ ＊
#
3 结果 Aβ+SA group，P＜0.05
Δ
3.1 各组细胞的形态 3.3 各组PC12细胞PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、GSK3β、
对照组细胞形态饱满、细胞密集且连接紧密、折光 p-GSK3β蛋白水平
性好。与对照组比较，Aβ组细胞突触变少、部分突触断 与对照组比较，Aβ 组细胞中 p-PI3K/PI3K、p-Akt/
裂消失、细胞变少且细胞间连接较松；与Aβ组比较，Aβ+ Akt、p-GSK3β/GSK3β比值均显著降低（P＜0.05 或 P＜
SA 组细胞变圆、突触增多；与 Aβ+SA 组比较，Aβ+SA+ 0.01）；与 Aβ组比较，Aβ+SA 组细胞中 p-PI3K/PI3K、
LY组细胞形态较不规则、部分突触损伤断裂、细胞光圈 p-Akt/Akt、p-GSK3β/GSK3β比值均显著升高（P＜0.05）；

中国药房 2020年第31卷第20期 China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 20 ·2521 ·