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微镜下观察股骨的病理学变化。                                     3 结果
        2.5  大鼠骨组织中BMP、Runx2、Osx mRNA表达情况                  3.1  淫羊藿总黄酮对PMOP模型大鼠股骨、椎骨BMD
        检测                                                 的影响
            采用实时荧光定量-PCR法进行检测。取大鼠右侧                            与假手术组比较，模型组大鼠股骨、椎骨BMD显著
        股骨洗净，取部分骨片（另一部分保存于－80 ℃）。采用                        降低（P＜0.01）；与模型组比较，淫羊藿总黄酮低、高剂
        Trizol 法提取其总 RNA，确定其纯度和浓度后，将总                      量组和雌二醇组大鼠股骨、椎骨 BMD 均显著升高（P＜
        RNA反转录合成cDNA，并以cDNA为模板进行PCR扩                       0.05 或 P＜0.01）；与淫羊藿总黄酮低剂量组比较，淫羊
        增。反应体系（共20 µL）：SYBR荧光染料10 μL，上、下                   藿总黄酮高剂量组和雌二醇组大鼠股骨BMD显著升高
        游引物各2 μL，cDNA模板4 μL，无核酸酶水2 μL。反应                   （P＜0.05）；与雌二醇组比较，淫羊藿总黄酮高剂量组大
        条件：94 ℃预变性 5 min；95 ℃变性 30 s，60 ℃退火 30             鼠股骨、椎骨BMD差异均无统计学意义（P＞0.05）。各
        s，72 ℃延伸1 min ，共40个循环。以GAPDH作为内参，                  组大鼠股骨、椎骨BMD测定结果见表2。
        采用 2 －ΔΔCt 法计算各目标基因 mRNA 的表达水平（式中                   表2 各组大鼠股骨、椎骨BMD测定结果（x±±s，n＝10）
        Ct 表示荧光信号强度达到设定阈值时经历的循环次                           Tab 2 BMD of femur and vertebrae of rats in each
        数）。引物由武汉擎科生物公司设计并提供，其引物序                                   group（x±±s，n＝10）
        列及产物大小见表1。                                         组别                  股骨BMD，g/cm 2    椎骨BMD，g/cm 2
                    表1 引物序列及产物大小                           假手术组                 0.43±0.02        0.33±0.01
                                                           模型组                  0.22±0.01 ＊＊     0.15±0.04 ＊＊
             Tab 1 Primary sequence and product size
                                                           淫羊藿总黄酮低剂量组           0.34±0.03 #      0.23±0.03 #
        基因名称             引物序列                 产物大小，bp      淫羊藿总黄酮高剂量组           0.45±0.04 ##Δ    0.29±0.02 ##
        BMP       上游：5′-CCCAGACCACCGGCTGGAGA-3′  903       雌二醇组                 0.40±0.02 ##Δ    0.27±0.01 ##
                  下游：5′-CGACACCCGCAACCCTCCAC-3′                注：与假手术组比较， P＜0.01；与模型组比较，P＜0.05，P＜
                                                                                                        ##
                                                                              ＊＊
                                                                                                 #
        Runx2     上游：5′-TGAGCGACGTGAGCCCGGTA-3′  883       0.01；与淫羊藿总黄酮低剂量组比较，P＜0.05
                                                                                     Δ
                  下游：5′-CGTGTGGAAGACAGCGGCGT-3′                                     ＊＊                  #
        Osx       上游：5′-GCCCACTGGTGCCCAAGACC-3′  829           Note：vs. sham operation group， P＜0.01；vs. model group，P＜
                                                               ##
                                                                                                        Δ
                  下游：5′-CCCGTGGGTGCGCTGATGTT-3′            0.05，P＜0.01；vs. E. brevicornu total flavonoids low-dose group，P＜
        GAPDH     上游：5′-TTGGCCGTATCGGACGCCTG-3′  876       0.05
                  下游：5′-GAGCAATGCCAGCCCCAGCA-3′            3.2  淫羊藿总黄酮对 PMOP 模型大鼠股骨微结构的
        2.6  大鼠骨组织中 BMP、Runx2、Osx 蛋白表达情况                   影响
        检测                                                     与假手术组比较，模型组大鼠股骨Tb.N、Tb.Th显著
            采用 Western blotting 法进行检测。取冷冻保存的               降低（P＜0.01），Tb.Sp 显著升高（P＜0.01）；与模型组比
        大鼠右股骨组织，每组随机取3个样本，用无菌眼科剪刀                          较，淫羊藿总黄酮低、高剂量组和雌二醇组大鼠股骨
        将其尽可能剪碎，置于研钵内研磨，加入裂解液使其充                           Tb.N、Tb.Th 显著升高（P＜0.05 或 P＜0.01），Tb.Sp 显著
        分裂解。裂解完毕后，以12 000 r/min离心15 min，取上                 降低（P＜0.05或P＜0.01）；与淫羊藿总黄酮低剂量组比
        清液，用BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度。蛋白经变                          较，淫羊藿总黄酮高剂量组和雌二醇组大鼠股骨 Tb.N、
        性后，取 50 µg 进行 SDS-PAGE 电泳（140 V），然后在               Tb.Th 显著升高（P＜0.05），Tb.Sp 显著降低（P＜0.05）；
        300 mA下转膜1 h至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上；TBST                   与雌二醇组比较，淫羊藿总黄酮高剂量组大鼠股骨Tb.N、
        缓冲液洗膜5 min×3次；将膜放入5％的脱脂奶粉中，室                       Tb.Th 显著升高（P＜0.05），Tb.Sp 差异无统计学意义
        温条件下封闭孵育 2 h；将膜取出后，用 TBST 缓冲液洗                     （P＞0.05）。各组大鼠股骨微结构 microCT 扫描图见图
        膜 5 min×3 次；分别加入 BMP、Runx2 和 Osx 一抗（稀释             1，Tb.N、Tb.Th、Tb.Sp测定结果见表3。
        度均为 1 ∶ 1 000），4 ℃孵育过夜；加入二抗（稀释度为                   3.3  淫羊藿总黄酮对 PMOP 模型大鼠血清中钙离子、
        1 ∶ 200），室温孵育1ｈ；以ECL试剂盒显色后，置于凝胶                    骨钙素、P1NP水平的影响
        成像系统上成像。采用Image J v1.5.1软件进行分析，以                       与假手术组比较，模型组大鼠血清中钙离子、骨钙
        目标蛋白条带灰度值与内参蛋白（GAPDH）条带灰度值                         素、P1NP 水平显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，淫羊
        的比值表示目标蛋白的表达水平。                                    藿总黄酮低、高剂量组和雌二醇组大鼠血清中钙离子、
        2.7 统计学方法                                          骨钙素、P1NP水平均显著升高（P＜0.05或P＜0.01）；与
            采用 SPSS 22.0 统计学软件对数据进行统计分析。                   淫羊藿总黄酮低剂量组比较，淫羊藿总黄酮高剂量组和
        符合正态分布的计量资料以x±s表示，多组间比较采用                          雌二醇组大鼠血清中钙离子、骨钙素、P1NP水平均显著
        单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；若不符                        升高（P＜0.05）；与雌二醇组比较，淫羊藿总黄酮高剂量
        合正态分布，则采用非参数检验进行组间比较。P＜                            组大鼠血清中P1NP水平显著升高（P＜0.05），血清中钙
        0.05表示差异具有统计学意义。                                   离子、骨钙素水平差异无统计学意义（P＞0.05）。各组


        中国药房    2020年第31卷第19期                                             China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 19  ·2335 ·
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