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骨质疏松症（OP）是以骨量低下、骨组织微结构损                        （HRP）标记羊抗鼠免疫球蛋白 G（IgG）二抗（批号：
        坏，导致骨脆性增加、易发生骨折为特征的全身性骨                             jx-1943）、二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量试剂盒（批号：
        病。随着我国人口的老龄化，OP患病率逐年增加，最新                           ED2582r）、实时荧光定量-PCR试剂盒（批号：ED37945r）
        调 查 显 示 ，我 国 40 岁 以 上 人 群 的 OP 发 病 率 高 达            均购自广州晶欣生物科技有限公司；苏木精、伊红染液
               [1]
                                                      [2]
        24.62％ ，其中绝经后骨质疏松症（PMOP）占比最大 。                     （武汉科诺生物科技有限公司）；其余试剂均为分析纯或
        目前，西医治疗OP的基础用药有钙剂、维生素D以及雌                           实验室常用试剂，水为蒸馏水。
              [2]
        激素等 ，但长期使用副作用较多              [3-4] 。                1.3 动物
            中医药在防治OP上具有独特优势，但其多成分、多                             50 只健康成年 SD 大鼠，SPF 级，雌性，6 月龄，体质
        靶点的作用机制复杂，尚未完全阐明。淫羊藿具有补                             量为 170～210 g，由广州中医药大学实验动物中心提
        肾、健骨等功效，临床常用于治疗肾虚、筋骨萎软等                             供[实验动物生产合格证号：SCXK（粤）2018-0034]。饲
        症 。现有研究已明确，淫羊藿抗OP的主要有效成分是                           养环境温度为（22±2）℃、相对湿度为50％。本研究通
          [5]
        以淫羊藿苷为代表的黄酮类化合物 ，其中淫羊藿总黄                            过广州中医药大学动物实验中心伦理委员会批准。
                                       [6]
                                                      [7]
        酮可促进骨髓间充质干细胞（BMSCs）的成骨性分化 ，                         2 方法
        并具有促进骨形成和抑制骨吸收的双重活性                    [8-9] ，但其信   2.1 分组、造模与给药
        号转导机制尚未明确。                                              选取50只SD大鼠，适应性喂养1周后，按体质量分
            相关研究显示，由骨形态发生蛋白（BMP）、Runt 相                     层法随机分为5组：假手术组，模型组，淫羊藿总黄酮低、
        关转录因子2（Runx2）、成骨细胞特异性转录因子（Osx）                      高剂量组和雌二醇组，每组10只。除假手术组外，其余
        组 成 的 BMP/RunX2/Osx 信 号 通 路 与 骨 形 成 密 切 相           4 组大鼠均采用卵巢摘除去势法建立 PMOP 模型 ，具
                                                                                                       [14]
                                               [13]
        关 [10-12] ，基于对淫羊藿的相关药理机制的研究 ，笔者推                    体操作为：用 10％水合氯醛将大鼠麻醉后，在其腰椎棘
        测淫羊藿总黄酮可能是通过 BMP/Runx2/Osx 通路防治                     突旁开1 cm处，沿着皮肤和肌肉纵向剖离1.5 cm左右的
        OP。本研究通过建立PMOP大鼠模型，探索淫羊藿总黄                          深度，在脂肪团中找到双侧卵巢并切除双侧卵巢；假手
        酮对其骨组织学和BMP/Runx2/Osx信号通路的影响，从                      术组大鼠采用同样的手术操作暴露卵巢，但不摘除。术
        而明确淫羊藿总黄酮防治OP的作用机制。                                 后腹腔注射青霉素（10万单位/d），连续3 d。术后大鼠正
        1 材料                                                常饲养，2 个月后开始灌胃给药，每天给药 1 次，连续给
        1.1  仪器                                             药 84 d（12 周）。其中，淫羊藿总黄酮低、高剂量组大鼠
            MK3型酶标仪（美国Bio-Rad公司）；ZF-208型凝胶                  的给药剂量分别为 265、530 mg/（kg·d）[分别为成人（体
        成像系统（上海恒勤仪器设备有限公司）；PIDRed 96 型                      质量以50 kg计）临床用量的1、2倍等效剂量]，雌二醇组
                                                                                      [15]
        聚合酶链式反应（PCR）仪（美国Thermo Fisher Scientific            大鼠的给药剂量为 0.09 mg/kg ，假手术组和模型组大
        公司）；RM2245 型冰冻切片机（北京世贸远东科学仪器                        鼠均灌胃等量生理盐水，给药体积均为1 mL/100 g。
        有限公司）；EG1150 型包埋机、SM2000R 石蜡滑动式切                    2.2  大鼠股骨、椎骨骨密度（BMD）和股骨微结构检测
        片机（德国Leica 公司）；BX-2型光学显微镜（日本Olym-                       末次给药结束后24 h，各组大鼠腹腔注射10％水合
        pus 公司）；Allegra X-15R 型医用离心机（美国 Beckman             氯醛麻醉，将其右股骨、椎骨部位置于双能 X 线密度仪
        公司）；Dexa Pro-1 型双能 X 射线骨密度仪（美国 GE 公                 上检测 BMD。将各组大鼠完整的股骨置于 microCT 系
        司）；JS-Power300 型电泳仪（上海迪奥生物科技有限公                     统上进行扫描，扫描完成后，通过Evaluation V6.5.3软件
        司）；SkyScan1272 型超高分辨率 microCT 系统（比利时                建模采集图像并对股骨微结构进行分析，采集骨小梁数
        Bruker公司）。                                          量（Tb.N）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁分离度（Tb.Sp）
        1.2 药品与试剂                                           等数据。
            淫羊藿总黄酮（江苏康缘阳光药业有限公司，批号：                         2.3 大鼠血清中钙离子、骨钙素、P1NP水平检测
        20198954，纯度：＞90％）；戊酸雌二醇片（廊坊高博京邦                         采用ELISA法进行检测。末次给药后1 h从大鼠的
        制药有限公司，批号：20191125，规格：2 mg/片）；血清钙                   腹主动脉取血 5 mL，放置 1 h 后，以 3 000 r/min 离心 10
        离子、骨钙素、Ⅰ型原胶原N端前肽（P1NP）酶联免疫吸                         min，分离上层血清。分别按照 ELISA 试剂盒说明书操
        附（ELISA）检测试剂盒（北京百奥莱博科技有限公司，                         作，检测血清中钙离子 、骨钙素、P1NP水平。
        批号：ZN2797349、ZN27840113、ZN27528941）；十二烷             2.4 大鼠股骨组织的病理学观察
        基硫酸钠-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝胶试剂盒（批号：                           采用苏木精-伊红（HE）染色法进行观察。取血后，
        ED2036r）、羊抗鼠 BMP 多克隆抗体（批号：jx-2350）、羊                将各组大鼠处死，取其左侧股骨，以10％甲醛固定，再用
        抗鼠 Runx2 多克隆抗体（批号：jx-2056）、羊抗鼠 Osx 多                20％EDTA脱钙液进行脱钙，然后进行脱水（60 min）；用
        克隆抗体（批号：jx-2752）、羊抗鼠甘油醛-3-磷酸脱氢酶                     二甲苯Ⅰ和Ⅱ进行透明（分别处理 60 min），常规浸蜡、
        （GAPDH）多克隆抗体（批号：jx-1379）、辣根过氧化物酶                    包埋后进行组织切片（4 µm）。行 HE 染色后，在光学显


        ·2334 ·  China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 19                                 中国药房    2020年第31卷第19期
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