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理学、计算机科学等多学科的技术和知识，可多方位地                           过NIST 11.L质谱数据库检索、匹配后，经人工解析并确
        阐释药物治疗疾病的潜在靶点及作用机制，体现了药物                           定各化学成分的结构。
        作用的整体性和系统性，与中药作用特点相一致                      [27-30] 。  2.3 网络药理学分析
        为此，本研究通过气质联用技术（GC-MS）对青皮挥发油                        2.3.1  青皮挥发油活性成分的筛选               将“2.2.3”项下已
        中的活性成分进行定性分析，并借助网络药理学的研究                           鉴定出的青皮挥发油成分输入至中药系统药理学分析
        思路对所鉴定出的化学成分进行信息挖掘，筛选出青皮                           平台（TCMSP，http：//lsp.nwu.du.cn/tcmsp.php），以口服
        挥发油防治 AD 的关键活性成分、关键作用靶点以及潜                         利用度（OB）≥30％、类药性（DL）≥0.18作为筛选条件                [31]
        在信号通路，旨在为青皮挥发油用于防治 AD 的深入研                         对青皮挥发油活性成分进行筛选。
        究提供参考。                                             2.3.2  青皮挥发油对应靶点的收集               将“2.3.1”项所得
        1 材料                                               青皮挥发油活性成分录入TCMSP和PharmMapper数据
        1.1 仪器                                             库（http：//www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/），限定物种
            7890A/5975C型GC-MS仪，配电子轰击（EI）离子源                为“人类（Homo sapiens）”。将检索所得各靶点以反向对
        以 及 5975C-GC/MSD 数 据 处 理 系 统（美 国 Agilent 公         接结合值（即 Fit 值）降序排列，选择前 20 位作为每个成
                                                                            [32]
        司）；TC-15 型恒温电热套（海宁市新华医疗器械厂）；                       分对应的主要靶点 。将上述主要靶点录入 UniProt 数
        Milli-Q型超纯水系统（美国Millipore公司）。                      据库（http：//www.uniprot.org），限定物种为“人类（Homo
        1.2 药材与试剂                                          sapiens）”，检索相应的UniProt ID，并获取对应的基因简
            青皮幼果采自江西省吉安市新干县山湖镇青皮种                          称（Gene symbol），去重后即得青皮挥发油活性成分的对
        植基地，经广东省中医药科学院黄志海教授鉴定为芸香                           应靶点。
        科植物橘（C. reticulata Blanco）的幼果。将其果皮上纵               2.3.3 AD 相关靶点的收集           以“Alzheimer’s disease”
        剖成四瓣至基部，除尽瓜瓣，将所得果皮部分自然晒干                           为关键词，在 GeneCards 数据库（https：//www.genecards.
        后，即得四花青皮药材。无水硫酸钠、甲苯、石油醚                            org/）、人类孟德尔遗传数据库（OMIM，https：//omim.
       （60～90 ℃）等试剂均为分析纯，水为超纯水。                            org/）中检索 AD 相关靶点。其中，GeneCards 数据库中
                                                                                                [33]
        2 方法                                               以相关分数（Relevance score）＞10 为标准 进行筛选。
        2.1  挥发油提取                                         将两个数据库的检索结果去重后，即得AD相关靶点。
            参照 2015 年版《中国药典》（四部）通则中“2204 挥                 2.3.4  青皮挥发油防治AD直接靶点的收集                 利用Ven-
        发油测定法”项下“甲法”操作：称取四花青皮药材50 g，                       ny 2.1.0 软件映射“2.3.2”“2.3.3”项下所得青皮挥发油活
        加10倍量（mL/g）水，浸泡2 h，回流提取9 h，得黄色透明                   性成分对应靶点和 AD 相关靶点，即得青皮挥发油防治
        液体，经无水硫酸钠干燥后，即得青皮挥发油。平行操                           AD的直接靶点。
        作3次。每克药材可得挥发油（1.367±0.058）mL。                      2.3.5  青皮挥发油防治AD作用靶点的确定                 为明确青
        2.2  GC-MS分析                                       皮挥发油成分靶点与疾病 AD 靶点之间的相互作用关
        2.2.1 GC 条件    色谱柱：HP-5MS 5 Phenyl-Methyl Si-      系，将“2.3.2”“2.3.3”项下所得青皮挥发油活性成分对应
        loxane石英毛细管柱（30 m×250 μm，0.25 μm）；升温程序             靶 点 和 AD 相 关 靶 点 导 入 STRING 数 据 库（https：//
       （初始温度 50.00 ℃，以 0.40 ℃/min 升至 55.92 ℃，以             string-db.org/），限定物种为“人类（Homo sapiens）”，设置
        0.20 ℃/min 升 至 58.00 ℃ ，再 以 15.00 ℃/min 升 至        较高置信度（High confidence）≥0.700 ，除去未相互连
                                                                                            [34]
        88.00 ℃并保持 2.00 min；以 1.30 ℃/min 升至 131.70 ℃，      接的节点（Node）后，得“靶点互作”网络并保存为“tsv”
        以 0.80 ℃/min 升 至 137.00 ℃ ，再 以 1.50 ℃/min 升 至      格式文件；将上述文件导入Cytoscape 7.2.1软件，运用软
        148.00 ℃ 并 保 持 2.00 min；以 15.00 ℃/min 升 至          件中的“CentiScaPe 2.2”插件计算节点度值（Degree），选
        248.00 ℃，以20.00 ℃/min升至280.00 ℃。总运行时间：             取度值大于平均度值 2 倍的靶点作为核心节点（Hub
                                                                [35]
        87.04 min）；进样口温度：250 ℃；气化室温度：250 ℃；载               node） 。利用 Venny 2.1.0 软件将该核心靶点与“2.3.2”
        气（氦气）流速：1.0 mL/min；进样量：1.0 μL；进样方式： “2.3.3”项下所得青皮挥发油活性成分对应靶点和AD相
        分流进样，分流比：10∶1。                                     关靶点进行映射，选择与活性成分对应靶点的交集靶
        2.2.2 MS 条件     离子源：EI 离子源；离子源温度：                  点，在排除与“2.3.4”项下直接靶点重复的靶点之后，即
        230 ℃；四极杆温度：150 ℃；电子轰击能量：70 eV；溶剂                  得青皮挥发油防治AD的间接靶点。将直接靶点与间接
        延迟：3 min；扫描范围：m/z 50～500。                          靶点合并，即得青皮挥发油防治AD作用靶点。
        2.2.3  青皮挥发油成分分析          取“2.1”项下青皮挥发油，           2.3.6  基因本体（GO）功能和KEGG通路富集分析                  将
        用适量石油醚溶解后，按“2.2.1”“2.2.2”项下 GC-MS 条               “2.3.5”项下所得青皮挥发油防治 AD 作用靶点录入
        件进样分析，记录色谱图和质谱数据。所得质谱数据通                           DAVID 6.7 数据库（https：//david-d.ncifcrf.gov/summary.


        中国药房    2020年第31卷第17期                                             China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 17  ·2095 ·
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