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观察小鼠呼吸、心跳，待其恢复正常后即可缝合皮肤。                           2.6 小鼠皮质中Bcl-2蛋白表达情况检测
        2.2 分组与给药                                              采用免疫荧光法检测各组小鼠皮质中Bcl-2蛋白表
            根据前期预实验结果设置给药剂量。将 60 只 VD                      达情况。各组随机取3只小鼠左侧大脑皮质置于4％多
        模型小鼠随机分为模型组、人参皂苷Rb3组（10 mg/kg）、                    聚甲醛中固定 24 h，常规脱水，石蜡包埋、切片、脱蜡至
        β-细辛醚组（10 mg/kg）、联合用药组（人参皂苷 Rb3 10                 水后，于3％双氧水中浸泡30 min，用柠檬酸钠进行抗原
        mg/kg+β-细辛醚 10 mg/kg）、阳性对照组（盐酸多奈哌                  修复，恢复室温后用组化笔划圈，磷酸盐缓冲液（PBS，
        齐，1 mg/kg）和Akt抑制剂组（LY294002，1 mg/kg），并另            pH 7.0）漂洗 3 次，每次 5 min，随后滴加正常山羊血清，
        设假手术组（按“2.1”项下方法操作，但不行缺血再灌                         室温下孵育30 min，不漂洗直接滴加Bcl-2一抗（稀释比
        注），每组 10 只。模型组和假手术组小鼠灌胃等体积生                        例为1 ∶ 50），37 ℃孵育2 h；PBS漂洗3次，每次5 min；滴
        理盐水，Akt抑制剂组小鼠腹腔注射相应药物，其余各组                         加生物素（稀释比例为 1 ∶ 100），室温孵育 30 min；滴加
        小鼠灌胃相应药物，每日2次，连续30 d。                              SABC-FITC（稀释比例为1∶200），室温避光孵育30 min；
        2.3 小鼠学习记忆能力评价                                     PBS 漂洗 3 次，每次 5 min。用 4′，6-二脒基-2-苯基吲哚
            采用避暗实验评价各组小鼠的学习记忆能力。第                          （DAPI）室温避光孵育 5 min，PBS 漂洗 3 次，每次 5 min，
        29 天给药结束后，将各组小鼠置于避暗仪中适应 2 min                      最后用防荧光淬灭封片，在荧光显微镜下观察 Bcl-2 荧
        后，将其背对暗室的洞口放入明室。小鼠进入暗室，受                           光强度并以阳性细胞百分比表示其蛋白表达水平。
        到电击后逃出暗室，如此训练5 min。24 h后（即末次给                      2.7 小鼠海马组织中Bcl-2和Bax蛋白表达情况检测
        药后）正式检测，将每只小鼠分别置于明室，记录其从明                              采用 Western blotting 法检测各组小鼠海马组织中
        室第1次进入暗室的时间（避暗潜伏期）和5 min内小鼠                        Bcl-2 和 Bax 蛋白表达情况。各组随机取 3 只小鼠右侧
        进入暗室的次数（错误次数）。                                     海马组织，称定质量，加入现配的含蛋白酶抑制剂的蛋
        2.4  小鼠海马组织中4-HNE、8-OHdG、ROS含量检测                   白裂解液，冰上匀浆促其充分裂解，于4 ℃下12 000 r/min
            采用 ELISA 法检测各组小鼠海马组织中 4-HNE、                   离心 10 min，取其上清液以 BCA 法检测蛋白质浓度。
        8-OHdG、ROS含量。避暗实验结束后，颈椎脱臼处死各                       取煮沸变性后的蛋白样本 40 μg，以 10％聚丙烯酰胺
        组小鼠，迅速取出其左侧海马组织，精密称定质量后以                           凝胶进行电泳分离，湿法转膜，再以 5％牛血清白蛋
        生理盐水制成10％海马组织匀浆，于4 ℃、3 500 r/min条                  白室温封闭 1 h，加入 Bcl-2、Bax、GAPDH 一抗（稀释比
        件下离心 15 min，吸取上清液，使用酶标仪检测各组小                       例均为 1 ∶ 1 000），于 4 ℃孵育过夜，再用 TBST 溶液清
        鼠海马组织中4-HNE、8-OHdG、ROS含量。严格按照相                     洗；加入 HRP 标记的山羊抗兔 IgG 二抗于室温下孵育 1
        应试剂盒说明书操作。                                         h，再用 TBST 溶液清洗。经 ECL 化学发光液显影和定
        2.5  小鼠海马组织中Bcl-2、Bax mRNA表达情况检测                   影后采用 Image J 8.0 软件分析，以目标蛋白与内标
            采用实时荧光定量 PCR 法检测各组小鼠海马组织                       （GAPDH）的灰度值比值表示该蛋白的表达水平。
        中Bcl-2、Bax mRNA表达情况。取各组小鼠右侧部分海                     2.8  统计学方法
        马组织，按照Trizol试剂盒操作提取总RNA，根据Prime-                       采用SPSS 17.0软件对数据进行统计分析。所有数
        Script TM  RT Reagent Kit 说明书操作逆转录得 cDNA，置         据均以x±s表示，两两比较采用t检验。P＜0.05表示差
                                                           异有统计学意义。
        PCR 仪中进行扩增。反应体系（共 25 μL）：2×SYBR               ®
                                                           3 结果
        Premix Ex TaqⅡ12.5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，
        DNA 模板 2 μL，ddH2O 8.5 μL。反应条件：95 ℃预变性              3.1  小鼠学习记忆能力
        3 min；95 ℃变性 30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，            与假手术组比较，模型组小鼠的避暗潜伏期显著缩
                                                           短，错误次数显著增多（P＜0.01）。与模型组比较，人参
        40 次循环。以β-actin 为内参，使用 2       －ΔΔCt 法分析各组小
                                                           皂苷Rb3组、β-细辛醚组、联合用药组和阳性对照组小鼠
        鼠海马组织中Bcl-2、Bax mRNA的表达水平。引物序列
                                                           的避暗潜伏期均显著延长，错误次数均显著减少（P＜
        及产物长度见表1。
                                                           0.05 或 P＜0.01）；而 Akt 抑制剂组小鼠的避暗潜伏期显
                    表1 引物序列及产物长度
             Tab 1 Primer sequence and product length      著缩短，错误次数显著增多（P＜0.05）。与人参皂苷Rb3
                                                           组、β-细辛醚组、Akt 抑制剂组比较，联合用药组小鼠的
        基因名称                引物序列                产物长度，bp
        Bcl-2         上游：5′-GCGTCAACAGGGAGATGTCA-3′  138   避暗潜伏期显著延长，错误次数显著减少（P＜0.05 或
                      下游：5′-GCATGCTGGGGCCATATAGT-3′        P＜0.01）。各组小鼠学习记忆能力的变化情况见表2。
        Bax           上游：5′-CTGGATCCAAGACCAGGGTG-3′  96    3.2 小鼠海马组织中4-HNE、8-OHdG和ROS含量
                      下游：5′-GTGAGGACTCCAGCCACAAA-3′
        β-actin       上游：5′-ACACTCTCCCAGAAGGAGGG-3′  147       与假手术组比较，模型组小鼠海马组织中 4-HNE、
                      下游：5′-TTTATAGGACGCCACAGCGG-3′        8-OHdG、ROS 含量均显著升高（P＜0.01）。与模型组比


        中国药房    2020年第31卷第16期                                            China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 16  ·1969 ·
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