Page 25 - 202015
P. 25

分光光度计（美国 Thermo Fisher Scientific 公司）；2100         于小鼠眼眶取血适量至 1.5 mL 离心管中，在 4 ℃下以
        型生物分析仪、1260 型高效液相色谱（HPLC）仪（美国                      4 500×g离心10 min，分离血清，分别采用单试剂比色法
        Agilent公司）；Y10型超细匀浆机（上海翼控机电有限公                     和直接测定法以酶标仪检测小鼠血清 TC 和 LDL-C 水
        司）；ME204E型电子天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有                      平，严格按照相应试剂盒说明书操作。
        限公司；TGL16M 型台式高速冷冻离心机（长沙迈佳森                        2.4 小鼠肝组织RNA提取
        仪器设备有限公司）；BGISEQ-500RS 基因测序仪（华大                        根据“2.3”项下检测结果，每组各随机筛选 5 只小
        基因公司）；Accu-Chek 活力型血糖（BG）仪及配套试纸                    鼠，取其肝组织进行 RNA 提取。取肝组织样品，加入
                           ®
       （德国 Roche 公司）；C1000 Touch 型多功能梯度 PCR 仪              TRIzol 试剂适量，冰上涡旋匀浆；取匀浆液用氯仿 200
       （德国 Eppendorf 公司）；CFX96 Touch 型实时荧光定量               μL萃取，在4 ℃下以12 000×g离心15 min；取上清液，用
        PCR仪（美国Bio-Rad公司）。                                 异丙醇 500 μL 萃取以富集 RNA，在 4 ℃下以 12 000×g
        1.2 药品与试剂                                          离心 15 min；取沉淀（即总 RNA），用 75％乙醇清洗，在
            GPs（陕西中鑫生物技术有限公司，批号：150522，含                   4 ℃下以 12 000×g 离心 15 min；沉淀以适量 DEPC 水溶
        量：98.16％）；羧甲基纤维钠（CMC-Na，成都市科龙化工                    解，使用超微量分光光度计检测总 RNA 样品的浓度和
        试剂厂）；TC、LDL-C检测试剂盒（南京建成生物工程研                       纯度[以光密度比值（OD260 nm/OD280 nm ）表示]。
        究所，批号分别为20160311、20160309）；TRIzol试剂（美
                                                           2.5 cDNA建库与RNA-Seq测序
        国Invitrogen公司）；焦碳酸二乙酯（DEPC）水（北京索莱
                                                               选择“2.4”项下质量合格[即经生物分析检测，RNA
        宝科技有限公司）；PrimeScpipt      TM  RT Reagent Kit 逆转录
                                                           完整性（RIN）≥7.0、28S/18S≥1.5] 的总 RNA 为模板，
                                                                                         [19]
        试剂盒（日本 Takara 公司）；SYBR Green Super Mix 试
                                     ®
                                                           逆 转 为 cDNA 以 构 建 文 库 ，运 用 BGISEQ-500RS
        剂（美国Bio-Rad公司）；异丙醇、氯仿和无水乙醇等均为
                                                           RNA-Seq 测序平台（https：//www.mgitech.cn/product/de-
        分析级，水为超纯水。
                                                           tail/BGISEQ-500.html）进行测序。参照 GRCm38/mm10
        1.3  动物与饲料
                                                           小鼠基因组进行比对和注释，用 FPKM（Fragments per
            SPF 级雄性 C57BL/6J 小鼠，体质量为（23±2）g，购
                                                           kilobase milliom，即在每百万个Reads值中，来自某基因
        自北京华阜康生物科技有限公司，动物生产许可证号：
                                                           每千个碱基长度的 Reads 值）作为 Reads 值的标准化数
        SCXK（京）2014-0004。普通饲料（含 23.2％蛋白质、
                                                           值输出矩阵，采用R语言中“MixOmics”工具包对该矩阵
        12.1％脂肪、64.7％碳水化合物）由江苏协同医药生物工
                                                           进行主成分分析（PCA）。从矩阵中提取 21 个 Mups 的
        程有限责任公司提供，高脂饲料（含 20.0％蛋白质、
                                                           FPKM 值，运用 GraphPad Prism 8.0.2 软件绘制火山图、
        60.0％脂肪、20.0％碳水化合物）由美国Research Diets公
                                                           散点图以筛选出表达量（以经 FRKM 进行标准化的
        司提供。
                                                           Reads值表示）显著变化的差异基因（P＜0.05）。
        2 方法
                                                           2.6  差异基因的RT-qPCR验证
        2.1  GPs检测
                                                               随机选取 ND、HFD 组小鼠各 4 只，取其肝组织适
            称取 GPs 约 100 mg，精密加入 80％甲醇 10 mL，称
                                                           量，按“2.4”方法提取 RNA 后，再按照 PrimeScpipt         TM  RT
        定质量，超声（功率：40 W，频率：45 kHz）处理40 min后，
                                                           Reagent Kit逆转录试剂盒说明书操作，将RNA逆转录成
        冷却至室温，再次称定质量，用 80％甲醇补足减失的质
                                                           cDNA。逆转录条件：25 ℃预热 10 min，37 ℃逆转录 2
        量，经0.22 µm滤膜滤过后，取续滤液，即得供试品溶液，
                                                           h，85 ℃逆转录酶失活 5 min。以上述 cDNA 为模板，进
                                 [17]
        按本课题组前期所建HPLC法 进行定性分析。
                                                           行扩增，反应体系（共10 µL）：cDNA模板2 µL，上、下游
        2.2 分组、造模与给药
                                                           引物（引物序列见表 1）各 0.06 µL，2×SYBR Green Su-
                                                                                                 ®
            所有小鼠均适应性喂养 1 周后，按体质量（BW）分
                                                           per Mix 5 µL，DEPC 水 2.88 µL；反应条件：95 ℃预变性
        为对照（ND）组、高胆固醇血脂症模型（HFD）组、GPs 治
        疗（GP）组，每组 11 只。按本课题组前期研究方法 操                       3 min；94 ℃变性 10 s，60 ℃延伸 45 s，共 39 个循环。以
                                                    [18]
        作：ND 组小鼠给予普通饲料，HFD 组和 GP 组小鼠均给                     GAPDH基因为内参，采用2          －ΔΔCt 法以Bio-Rad CFX Man-
        予高脂饲料，共饲养 38 周。于饲养的第 17 周起，GP 组                    ager v3.1软件计算各目标mRNA的相对表达量。
        小鼠灌胃 GPs 混悬液[250 mg/kg，溶剂为 0.1％CMC-Na                           表1 RT-qPCR 引物序列
        溶液]，ND组和HFD组小鼠均灌胃等体积0.1％CMC-Na                              Tab 1  RT-qPCR primer sequence
        溶液，灌胃体积均为0.1 mL/10 g，每日1次，连续22周。                   基因    上游引物（5′→3′）           下游引物（5′→3′）
                                                           Mup4  TTGACTTAACCAAAACCAATCGCTG  TGTGAGACAGGATGGAAAGCAGATC
        2.3  小鼠BW以及BG、血脂水平检测
                                                           Mup5  ATGGAGCTCTTTGGTCGA    TGTATGGAAGGGAAGGGATG
            于末次给药后，称量并记录小鼠 BW。于小鼠尾静                        Mup21  AGCTGAGGAGTGGAGTGTAGGC  ACACAGCAGCAGCAGCAACAG
        脉取血适量，使用 BG 仪及配套试纸测定其 BG 水平。                       GAPDH  TGTGTCCGTCGTGGATCTGA  CCTGCTTCACCACCTTCTTGA
        中国药房    2020年第31卷第15期                                             China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 15  ·1811  ·
   20   21   22   23   24   25   26   27   28   29   30