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蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、                     低、高剂量组（4、8 g/kg，按生药总量计；给药剂量参照成
        丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）测定试剂                       人临床等效剂量的0.25、0.5倍按体表面积法换算而得），
        盒（中生北控生物科技股份有限公司，批号分别为                             雷公藤多苷片组（9 mg/kg，给药剂量参照成人临床等效
        171419、171341、183531、183537、183642、182011、         剂量按体表面积法换算而得）以及参芪蛭龙汤低、高剂
        167651、170641、170541、182661、171351）；微量总蛋白          量+雷公藤多苷片组（剂量与各单药组相同），每组 10
        测定试剂盒[德赛诊断系统（上海）有限公司，批号：                           只。空白对照组和模型对照组大鼠灌胃等体积水，各给
        6012790]；兔抗大鼠TGF-β1、HPA-1抗体（美国Affinity公            药组大鼠灌胃相应药物10 mL/kg，每日1次，连续4周。
        司，批号分别为 AF1027、AF6086）；辣根过氧化物酶                     2.3 相关指标检测
       （HRP）标记的山羊抗兔免疫球蛋白 G（IgG）二抗（美国                       2.3.1 UTP   末次给药前 1 天，留取各组大鼠的 24 h 尿
        Thermo Fisher Scientific 公司，批号：31490）；山羊血清、        液，采用邻苯三酚红比色法以全自动生化分析仪检测大
        二氨基联苯胺（DAB）显色液、苏木精染液、2.5％Gluta固                    鼠 24 h UTP。严格参照微量总蛋白测定试剂盒说明书
        定液（电镜专用）（北京索莱宝科技有限公司，批号分别为                         操作。
        20170203、20170508、20180612、20180202）；柠檬酸钠抗         2.3.2  血常规指标       末次给药后 1 h，各组大鼠腹腔注
        原修复液（北京碧云天科技有限公司，批号：20170815）；                     射5％水合氯醛溶液（0.7 mL/100 g）进行麻醉，于腹主动
        磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.2，美国 GE Healthcare Life            脉取血。血样经乙二胺四乙酸二钾（EDTA-K2 ）抗凝后，
        Sciences 公司）；柠檬酸铅（海德创业北京生物科技有限                     采用全自动血液分析仪检测血浆中白细胞（WBC）、红细
                                                           胞（RBC）、血小板（PLT）计数。
        公司）；3％醋酸铀（西安鼎天化工有限公司）；过氧化氢、
                                                           2.3.3  血液生化指标        在各组大鼠麻醉后分别用枸橼
        二甲苯、无水乙醇等试剂均为分析纯，水为蒸馏水。
                                                           酸钠抗凝采血管及不含抗凝剂的采血管于腹主动脉取
        1.3  动物
                                                           血，血样以3 000 r/min 离心 10 min，分离血浆及血清，分
            清洁级Wistar大鼠，雌雄各半，体质量（228±19）g，
                                                           别采用溴甲酚绿微板法、双缩脲比色法、直接法-选择抑
        由黑龙江中医药大学实验动物中心提供，动物生产合格
                                                           制法、甘油磷酸氧化酶-过氧化物法、直接法-表面活性剂
        证号：SCXK（黑）2016-003。
                                                           清除法、双抗体夹心法、丙氨酸底物法、天门冬氨酸底物
        2 方法
                                                           法、固相夹心法、葡萄糖氧化酶法，以全自动生化分析仪
        2.1  参芪蛭龙汤药液制备
                                                           测定大鼠血浆中的ALB、TP、HDL-C、TG、TC、LDL-C以
            取党参 20 g、黄芪 30 g、当归 15 g、川芎 15 g、水蛭 5
                                                           及血清中BUN、ALT、AST、Scr、GLU的含量。严格按照
        g（需研末）、地龙20 g、僵蚕15 g、虎杖15 g、淫羊藿30 g、
                                                           相应试剂盒说明书操作。
        凤尾草15 g，加12倍量（约2 160 mL）水浸泡1 h，加热至
                                                           2.3.4  大鼠肾组织超微结构改变观察                取血后处死大
        沸腾后，武火煎煮 1 h，滤过；药渣加 10 倍量水（约 1 800
                                                           鼠，取其肾皮质适量（大小约 1 mm×1 mm×1 mm），于
        mL），再次武火煎煮 1 h，滤过。合并两次滤液，浓缩至
                                                           2.5％ Gluta固定液中固定24 h，经乙醇梯度脱水、环氧树
        0.8 g/mL（按生药总量计），置于 4 ℃冰箱中保存，备用。
                                                           脂包埋后，切片（厚度约60 nm）。将切片置于铜网上，用
        给药时用水适量稀释。
                                                           3％醋酸铀-柠檬酸铅溶液染色后，用透射电子显微镜观
        2.2  造模、分组与给药
                                                           察大鼠肾脏中肾小球足细胞等超微结构的变化情况。
            所有大鼠均适应性喂养 3 d 后，随机分为空白对照                      2.3.5  大鼠肾组织中TGF-β 1、HPA-1蛋白表达检测              采
        组（10 只）和造模组（60 只）。参照 Border 法            [12-13] ，取  用免疫组织化学法检测。各组大鼠处死后取肾组织适
        C-BSA冻干粉160 mg溶于PBS 30 mL中，与等体积的不                  量，经乙醇梯度脱水、二甲苯透明后，用石蜡包埋，切片
        完全弗氏佐剂混合后，超声（功率：250 W，频率：40 kHz）                   （厚度约5 μm）。切片脱蜡后，用柠檬酸钠抗原修复液修
        使其完全乳化。取上述乳化液适量，于造模组大鼠腋窝                           复抗原10 min，然后于室温条件下，用3％过氧化氢溶液
        和腹股沟区域内的 6 个不同部位进行皮下注射，每处                          孵育 15 min 后，滴加山羊血清封闭 15 min，加入相应一
        0.05 mL，每只注射总体积为 0.3 mL。1 周后，于造模组                  抗（稀释度均为 1 ∶ 200），于 4 ℃孵育过夜；加入二抗（稀
        大鼠尾静脉注射乳化液，每次 16 mg/kg（以 C-BSA 质                   释度为 1 ∶ 500），于 37 ℃孵育 30 min；滴加 DAB 显色液
        量计，下同），每周注射3次，隔天1次，在6周内将注射剂                        100 μL，显色后以苏木精复染，经乙醇脱水、二甲苯透明
        量逐渐增加至 25 mg/kg。于造模第 3 周（以首次尾静脉                    后，用中性树胶封片。使用荧光正置显微镜观察大鼠
        注射开始计算），测定大鼠24 h尿蛋白定量（UTP），若超                      肾脏组织中 TGF-β 1、HPA-1 蛋白的表达情况，应用 Im-
                             [14]
        过 20 mg 即为造模成功 。将造模成功的大鼠（共 60                      age J 1.8.0 软件分析上述蛋白阳性细胞（即胞浆呈深棕
        只）按体质量和 UTP 随机分为模型对照组，参芪蛭龙汤                        色者）占细胞总数的百分比（以下简称“阳性细胞百分


        中国药房    2020年第31卷第13期                                             China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 13  ·1577  ·
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