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GB14146、GB11159、GB11403、GB12304、GB11507）以          2.3 大鼠胃肠动力检测
        及花菁染料3（Cy3）标记的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）                          各组大鼠眼眶采血后继续禁食不禁水12 h（以确保
        二抗、辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔 IgG 二抗                      大鼠未处于应激状态），然后灌胃5％炭末阿拉伯胶混悬
       （批号分别为GB21303、GB23204）均购自武汉塞维尔生                     液（参照文献方法          [11] 配制）50 mg/kg，记录灌胃质量
        物科技有限公司；甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）小鼠                       （M1 ）。灌胃 30 min 后处死大鼠，开腹结扎贲门和幽门，
        单克隆抗体（北京义翘神州生物技术有限公司，批号：                           测定幽门至盲肠（不含盲肠）的总长度（a），记录各组大
        100242-MM05）；BCA 蛋 白 浓 度 测 定 试 剂 盒（批 号 ：           鼠幽门至炭末类固体糊前端的推进距离（b），按公式计
        P0010S）、RIPA裂解液（批号：P0013B）、超敏ECL化学发                算小肠推进比：小肠推进比＝b/a×100％。剖取完整胃
        光试剂盒（批号：P0018AS）以及DAPI染色液、牛血清白                     组织，吸除多余血水后称定总质量（M2 ），再沿胃大弯剖
        蛋白（BSA）、二氨基联苯胺（DAB）显色试剂盒及蛋白上                       开胃后去除残余胃容物并称定净质量（M3 ），按公式计算
        样缓冲液均购自上海碧云天生物技术有限公司；磷酸盐                           胃排空率：胃排空率＝[1－（M2－M3 ）/M1]×100％。取部
        缓冲液（PBS，以色列 BI 公司，批号：020241ACS；工作                  分胃窦组织在－20 ℃下冻存，其余部分进行后续切片制
        pH为7.45）；枸橼酸缓冲液即用型干粉（广州赛国生物科                       备及相关检测。
        技有限公司，批号：BL604A；工作 pH 为 6.0）；12％十二                 2.4 大鼠胃窦组织中S100β表达情况检测
        烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）预制胶                           采用免疫荧光法检测。取“2.3”项下各组大鼠胃窦
       （上海瑞楚生物科技有限公司，批号：R07027）；氯化钠注                       组织适量，行常规石蜡包埋后切片（厚度约 5 μm），再经
        射液（中国大冢制药有限公司，批号：20190628，规格：                      二甲苯、无水乙醇脱蜡水化后，加入0.01 mol/L枸橼酸缓
        500 mL∶ 4.5 g；作生理盐水用）；二甲苯、无水乙醇等其余                  冲液，在98 ℃ 下高温处理20 min修复抗原；以PBS漂洗
        试剂均为分析纯或由实验室自行配制，水为超纯水。                            切片 3 次去除修复液，在 5％BSA 溶液中室温封闭 30
        1.3  动物                                            min；加入 S100β抗体（稀释度为 1 ∶ 500），在 4 ℃下孵育
            SPF 级老年 SD 大鼠 40 只，雄性，16 月龄，体质量为               过夜；以PBS漂洗切片3次去除一抗孵育液，加入Cy3标
       （300.0±20.0）g，购自南通大学实验动物中心，动物生产                     记的山羊抗兔IgG二抗（稀释度为1∶1 000），室温下避光
        许可证号：SCXK（苏）20190001。大鼠分笼饲养，饲养条                    孵育30 min；以PBS漂洗切片3次去除二抗孵育液，加入
        件为（23.0±2.0）℃恒温、（60.0±5.0）％恒湿、自然光昼                 DAPI 染色液，于室温核染 5 min 后封片，采用激光共聚
        夜交替。大鼠适应性喂养1周后进行实验，实验操作严                           焦显微镜观察大鼠胃窦组织中 S100β的表达情况（镜下
        格遵守动物实验伦理要求的相关规定。                                  S100β阳性表达呈红色荧光，胃窦组织细胞核经DAPI染
        2 方法                                               色后呈蓝色荧光）。
        2.1  分组、造模与给药                                      2.5  免疫组织化学法检测大鼠胃窦组织中GDNF表达
            取老年大鼠 40 只，随机分为空白对照组、模型组以                      情况检测
        及积雪草总苷低、中、高剂量组，每组8只。除空白对照                              采用免疫组织化学法检测。取“2.3”项下各组大鼠
        组大鼠正常饮食外，其余组大鼠均采用不规则饮食联合                           胃窦组织适量，按“2.4”项下方法制备大鼠胃窦组织切片
                            [9]
        夹尾刺激的复合造模法 复制FD模型，造模时间持续4                          并进行抗原修复；以 PBS 漂洗切片 3 次去除修复液，在
        周。造模结束后观察大鼠一般情况，根据前期预实验结                           5％BSA溶液中室温封闭30 min；加入GDNF抗体（稀释
        果，以大鼠毛色发黄、便溏、活动灵敏度下降、体质量减                          度为 1 ∶ 500），在 4 ℃下孵育过夜；以 PBS 漂洗 3 次去除
        轻、进食饮水量减少，且解剖观察（在实验结束后）示其                          一抗孵育液，加入 HRP 标记的山羊抗兔 IgG 二抗（稀释
        胃肠组织无器质性损伤为造模成功。造模完成后隔日，                           度为 1 ∶ 1 000），室温下孵育 1 h；以 PBS 漂洗切片 3 次去
        给药组大鼠分别灌胃低、中、高剂量的积雪草总苷药液                           除二抗孵育液，吸除多余水分，向切片中滴加DAB显色
       （15、30、60 mg/kg，以生理盐水配制；剂量设置参照文献                    液，室温下反应5 min后，以PBS冲洗终止反应。上述切
            [10]
        方法 ），灌胃体积为200 μL；空白对照组和模型组大鼠                       片经乙醇梯度脱水后采用二甲苯透明，中性树胶封片，
        灌胃等容生理盐水。各组大鼠均每日灌胃1次，连续15                          晾干，采用倒置显微镜观察大鼠胃窦组织中GDNF的表
        d。给药期间，大鼠均自由饮水进食；观察大鼠一般情况                          达情况（镜下GDNF阳性表达呈棕黄色）。
        及胃肠道器质性损伤的发生情况。                                    2.6  大鼠胃窦组织中 S100β、GFAP、PGP9.5、GDNF、
        2.2 大鼠血清中MTL、VIP的含量检测                              p-MEK、p-ERK1/2蛋白表达水平检测
            各组大鼠末次给药12 h后（期间禁食不禁水），在其                          采用Western blotting（WB）法检测。取“2.3”项下冷
        眼眶采血，收集血样至 EP 管中，在 37 ℃水浴中孵育 30                    冻保存的各组大鼠胃窦组织50～80 mg，充分剪碎，加入
        min 后，以 2 000 r/min 离心 5 min，分离上层血清。参照             RIPA 裂解液 0.5 mL 并置于冰上迅速研磨，提取组织总
        ELISA 试剂盒说明书操作，采用酶标仪检测血清中                          蛋白。收集组织总蛋白匀浆液，在4 ℃下以12 000 r/min
        MTL、VIP的含量。                                        离心15 min，取上清液，采用BCA法进行蛋白定量；加入


        中国药房    2020年第31卷第12期                                            China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 12  ·1431  ·
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