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2.3 大鼠血清中CD62P和CD63水平检测 放 置 30 min；滴 加 Notch2、Notch3、DLL1、JAG2 一 抗
采用 ELISA 法进行检测。自大鼠眼眶后静脉丛取 （1 ∶ 200），4 ℃过夜。次日使用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗
血，置于干净离心管中，4 ℃下静置4 h，然后在4 ℃下以 后，依操作顺序加入二抗（1 ∶ 100），37 ℃下孵育 15 min，
3 500 r/min 离心 10 min。取上层血清，按照 ELISA 试剂 PBS 冲洗；滴加辣根酶标记链霉卵白素（试剂 C），37 ℃
盒说明书操作，检测血小板活化标志物 CD62P 和 CD63 下 孵 育 15 min，PBS 冲 洗 ；室 温 下 以 二 氨 基 联 苯 胺
水平。 （DAB）显色，封片。采用显微镜观察，在细胞质或细胞
2.4 大鼠血清中GDF-15和NT-proBNP水平检测 核内出现黄、棕色颗粒为阳性细胞，并根据染色强度计
采用 ELISA 法进行检测。大鼠眼眶采血后，用 7％ 算免疫组化积分。将阳性细胞按染色强度进行评分：无
水合氯醛进行麻醉，腹主动脉取血，置于干净离心管中， 色为 0 分，淡黄色为 1 分，棕黄色为 2 分，棕褐色为 3 分
4 ℃下静置 4 h，然后在 4 ℃下以 3 500 r/min 离心 10 （染色深浅需与背景比较）。再将阳性细胞按所占的百
min。取上层血清，按照ELISA 试剂盒说明书操作，检测 分比进行评分：阴性为 0 分，阳性细胞比例≤10％为 1
GDF-15和NT-proBNP水平。 分，阳性细胞比例在＞10％～50％之间为2分，阳性细胞
2.5 大鼠肺组织病理学变化观察 比例在＞50％～75％之间为 3 分，阳性细胞比例＞75％
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为4分。两者评分的乘积即为免疫组化表达积分 。
采用苏木精-伊红染色（HE）法进行观察。大鼠腹主
2.7.2 Western blotting法检测 取大鼠肺组织放入玻璃
动脉取血后处死，迅速分离肺组织，用 4 ℃预冷的生理
匀浆器中，加入 RIPA 蛋白裂解液（每 20 mg 组织加入
盐水冲洗干净表面血液，并用滤纸吸干表面水分后，放
200 μL蛋白裂解液），匀浆，直至充分裂解。将匀浆液在
入 10％中性甲醛中固定 24 h，常规制备 5 μm 组织切片
4 ℃下以12 000 r/min离心10 min，将上清液移至另一干
并行HE染色后，在显微镜下进行组织病理学观察。
净离心管中，并加入上样缓冲液，混匀，100 ℃下水浴 5
2.6 大 鼠 肺 组 织 中 Notch2、Notch3、DLL1、JAG2
min，采用二喹啉甲酸（BCA）法测定蛋白浓度。取50 μg
mRNA表达水平检测
蛋白上样后，在300 mA、80 V条件下电泳至指示剂溴酚
采用实时荧光定量 PCR 法进行检测。取大鼠肺组
蓝迁移至分离胶与浓缩胶的分界处，调节电压为120 V，
织，按照RNA提取试剂盒说明书操作提取总RNA，检验
继续电泳至蛋白分离。根据蛋白质分子量切割目标蛋
其纯度后，按反转录试剂盒说明书操作反转录合成 cD- 白，并在 300 V、170 mA 条件下转印至聚偏二氟乙烯
NA 后进行 PCR 扩增。PCR 反应体系：cDNA 5 μL，2X
（PVDF）膜上。封闭液室温下封闭 1 h，分别经 Notch2、
PCR Master Mix 10 μL，上、下游引物各0.4 μL，双蒸水定
Notch3、DLL1、JAG2 和 GAPDH 抗体（1 ∶ 1 000）孵育后，
容至 20 μL。反应参数：95 ℃预变性 10 min；95 ℃变性 4 ℃下过夜。PBST充分洗膜后，加入二抗（1 ∶ 2 000），室
10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，40个循环。以β-ac- 温下孵育1 h。PBST清洗后显色液显影，采用凝胶成像
tin 为内参，采用 2 － Δ Δ c t 法计算 Notch2、Notch3、DLL1、 仪成像，应用Image J软件进行灰度值检测，以目的蛋白
JAG2 mRNA的表达水平。引物序列及扩增产物长度见 条带与内参蛋白（GAPDH）条带的灰度值比值表示目的
表1。 蛋白的表达水平。
表1 引物序列及扩增产物长度 2.9 统计学方法
Tab 1 Primer sequence and amplification product 采用 SPSS 19.0 统计学软件对数据进行分析，采用
length Graphpad Prism 5.0 软件进行作图。计量资料以 x±s 表

基因 引物名称 引物序列 产物长度，bp 示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采
Notch2 正向引物 5′-GATTACAAGTTGCCGCCATC-3′ 92 用LSD-t检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。
反向引物 5′-CTTTGACCACCGTTCTCCTC-3′
Notch3 正向引物 5′-CACCATCGGGAATGAACACTTC-3′ 138 3 结果
反向引物 5′-CTGTCAGCAATGCCTGGGTA-3′ 3.1 黄芩素对急性肺栓塞模型大鼠血浆血小板聚集率
DLL1 正向引物 5′-AGGAACAGGATGTCCAAATCG-3′ 219 及RPI的影响
反向引物 5′-AAGGGCATCCACATCACTCGGT-3′ 与正常对照组比较，模型对照组大鼠血浆ADP活化
JAG2 正向引物 5′-CAATCGGCTAAGAAGTCTGTC-3′ 201
反向引物 5′-AGGTGGGTACAGTGTAGCCT-3′ 后血小板聚集率、AA 活化后血小板聚集率及 RPI 值均
β-actin 正向引物 5′-GTGATTCATGCCGACGGCAG-3′ 186 显著升高（P＜0.05）。与模型对照组比较，黄芩素各剂
反向引物 5′-CAGGAGCATGGATTGGAGT-3′ 量组以及阳性药物组大鼠血浆 ADP 活化后血小板聚集
2.7 大鼠肺组织中 Notch2、Notch3、DLL1、JAG2 蛋白 率、AA 活化后血小板聚集率及 RPI 值均显著降低（P＜
表达水平检测 0.05），且黄芩素的作用呈现出一定的剂量依赖趋势。各
2.7.1 免疫组化法检测 将大鼠肺组织用4％多聚甲醛 组大鼠血浆血小板聚集率及RPI值测定结果见表2。
固定，石蜡包埋，常规制备3 μm切片。切片常规脱蜡至 3.2 黄芩素对急性肺栓塞模型大鼠血清中 CD62P 和
水，以3％双氧水室温下封闭20 min，以枸橼酸盐缓冲液 CD63水平的影响
加热抗原修复，以 5％胎牛血清（BSA）封闭，在 37 ℃下 与 正 常 对 照 组 比 较 ，模 型 对 照 组 大 鼠 血 清 中

中国药房 2020年第31卷第9期 China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 9 ·1093 ·