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型大孔吸附树脂 15 mL，置于玻璃柱中，分别加入 pH 为 响（P＞0.05）；因素D因离均差平方和最小，故被作为误
6的0.927 2 mg/mL草果总黄酮水溶液20 mL，吸附12 h， 差估计项。综合以上结果，最终确定 HPD450 型大孔吸
放出吸附液，并用适量水洗脱至流出液无色后，再用 附树脂纯化草果总黄酮的最佳工艺条件为A3B3C1D1，即
70％乙醇以1倍柱体积（BV）/h的速度洗脱，分段收集醇 上样液质量浓度1.854 4 mg/mL，上样液pH 7，乙醇体积
洗脱液，每1 BV收集1份，洗脱液浓缩蒸干，用甲醇定容 分数60％，乙醇洗脱用量8 BV。
至2 mL，吸取1 mL，经0.45 μm微孔滤膜滤过后，取续滤 2.6 验证试验
液适量，按“2.2.4”项下色谱条件进样分析，按“2.2.12”项 按“2.5”项下最佳纯化工艺平行操作3次，进行验证
下方法计算每BV洗脱液中的总黄酮含量。结果，在第9 试验：精密量取经预处理的 HPD450 型大孔吸附树脂
个 BV 的洗脱液中几乎没有总黄酮，提示此时洗脱基本 300 mL，湿法装柱，加入 pH 为 7、质量浓度为 1.854 4
完成，结果详见图3D。综合考虑，选择9 BV为最佳乙醇 mg/mL 的草果总黄酮水溶液 400 mL，吸附 12 h，放出吸
洗脱用量。 附液，并用适量水洗脱至流出液无色后，再用8 BV 60％
2.5 草果总黄酮纯化工艺优化的正交试验 乙醇进行洗脱，收集醇洗脱液，浓缩蒸干，用甲醇定容至
根据单因素试验结果，以上样液质量浓度（A）、上样 10 mL，吸取 1 mL，经 0.45 μm 微孔滤膜滤过后，取续滤
液pH（B）、乙醇体积分数（C）、乙醇洗脱用量（D）为考察 液适量，按“2.2.4”项下色谱条件进样分析，再按“2.2.12”
因素，以总黄酮含量为指标，采用L9 （3）表设计4因素3水 项下方法计算总黄酮含量。同时，取纯化前后的黄酮水
4
平的正交试验。因素和水平详见表 2，正交试验设计和 溶液 10 mL，置于蒸发皿中蒸干至恒质量，以适量甲醇
结果详见表3，方差分析结果见表4。 溶解后，同法测定两种浸膏中的总黄酮含量。结果，
表2 因素和水平 纯化后，总黄酮水溶液中的总黄酮平均含量由纯化前
Tab 2 Factors and levels 1.854 4 mg/mL 降 至 1.335 4 mg/mL，平 均 回 收 率 为

因素 72.01％；总黄酮浸膏中的总黄酮平均含量由纯化前
水平
A，mg/mL B C，％ D，BV 22.556 7 mg/g升至57.728 2 mg/g，纯化倍数为2.56，结果
1 0.463 6 5 60 8 详见表5。
2 0.927 2 6 70 9
3 1.854 4 7 80 10 表5 验证试验结果（n＝3）
表3 正交试验设计和结果 Tab 5 Results of validation tests（n＝3）
Tab 3 Design and results of orthogonal tests 试验号 总黄酮水溶液含量，mg/mL 回收率，％ 总黄酮浸膏含量，mg/g 纯化倍数
纯化前 纯化后 纯化前 纯化后
试验号 A B C D 总黄酮含量，mg/g 1 1.854 4 1.368 7 73.81 22.515 8 57.512 6 2.55
1 1 1 1 1 42.921 1 2 1.854 4 1.331 1 71.78 23.137 5 57.627 7 2.49
2 1 2 2 2 43.238 3 3 1.854 4 1.306 1 70.43 22.016 7 58.044 4 2.64
3 1 3 3 3 44.771 0 平均值 1.854 4 1.335 4 72.01 22.556 7 57.728 2 2.56
4 2 1 3 2 46.911 8
5 2 2 1 3 49.774 1 3 讨论
6 2 3 2 1 51.311 0 草果是药食两用中药材大宗品种之一，作为香料的
7 3 1 2 3 49.710 5 用量远大于药用，挥发油是其作为香料主要成分之一，
8 3 2 3 1 57.464 3
9 3 3 1 2 58.003 7 2015 年版《中国药典》（一部）也把测定挥发油含量作为
43.643 5 46.514 5 50.233 0 50.565 5 [1]
k1 评价草果品质的重要指标 。为更好地发挥草果药食两
49.332 3 50.158 9 48.086 6 49.384 6
k2 用的功效，很有必要对其非挥发性成分进行研究。黄酮
55.059 5 51.361 9 49.895 5 48.085 2
k3
R 11.416 0 4.847 4 2.146 4 2.480 3 作为草果中一类重要的非挥发性成分，具有抗氧化、清
[9]
表4 方差分析结果 除自由基的活性 。有学者对草果总黄酮进行了提取，
[9]
Tab 4 Results of variance analysis 但含量不高（24.2 mg/g） ，且目前尚未见草果总黄酮纯
因素 离均差平方和 自由度 均方和 F P 化工艺优化的相关报道，故本课题组开展了相关研究。
A 195.489 5 2 97.744 8 21.169 2 ＜0.05 目前，药材中黄酮含量的测定方法主要包括紫外分
B 38.226 7 2 19.113 4 4.139 5 ＞0.10 光光度法 、HPLC 法 [20-21] 、毛细管电泳法 等。其中，
[22]
[19]
C 61.258 7 2 30.629 4 6.633 6 ＞0.10
D（误差） 9.234 6 2 4.617 3 HPLC 法具有操作简便、高效、快速的特点，现已被广泛
注：F0.05（2，2） ＝19.00，F0.1（2，2） ＝9.00 应用于黄酮的定量分析中 [20-21] 。黄酮类化合物的分离多
Note：F0.05（2，2） ＝19.00，F0.1（2，2） ＝9.00 采用大孔吸附树脂和聚酰胺树脂。与后者相比，大孔吸
由表 3 可见，各因素对总黄酮含量的影响大小依次 附树脂具有吸附容量大、选择性好、再生简便、价格低廉
为A＞B＞D＞C，最优方案为A3B3C1D1。由表4可见，因 等优点，在黄酮类化合物的分离纯化中应用广泛 [13-14] 。基
素A对工艺有显著影响（P＜0.05）；B、C对工艺无显著影 于此，本研究以草果总黄酮含量为指标，以 HPLC 法作

中国药房 2020年第31卷第7期 China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 7 ·835 ·