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指标 。造模成功后，对模型组及盐酸班布特罗组大鼠 离子模式下的数据进行OPLS-DA分析。评价数据模型
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每天继续用香烟持续烟熏，每天 2 次，每次 30 min，每次 的参数有R Y和Q ，其中R Y表示所建模型对Y矩阵的解
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烟熏间隔 4 h；同时，盐酸班布特罗组大鼠灌胃相应药 释率，Q 表示模型的预测能力。一般情况下，R Y和Q 大
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物，正常组和模型组大鼠灌胃等体积的生理盐水，每天1 于0.5时，即可认为该模型可接受，其值越接近1代表模
次，连续给药45 d。 型拟合越准确、模型可靠性越高 。再将 m/z 数据输入
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2.3 肺泡灌洗液的制备与相关指标的检测 京都基因与基因组百科全书（KEGG）数据库（https：//
各组随机抽取6只大鼠，腹腔注射10％水合氯醛深 www.kegg.jp/）查询差异代谢物。
度麻醉后，颈椎脱臼处死，剪开颈部皮肤，暴露气管，从 为了更直观展示差异代谢物及对其进行差异代谢
气管小口处用6 mL生理盐水灌洗右肺2次，回抽收集肺 物的筛选，本文运用T检验和变异倍数分析得出差异倍
泡灌洗液。将肺泡灌洗液于 4 ℃下以 1 000 r/min 离心 数（Fold change）和 Q 值（Q-value）2 个指标，通常将差异
15 min，取上清液，按 IL-6、TNF-α ELISA 试剂盒说明书 倍数≥2 或≤0.5、Q 值≤0.05 作为筛选差异代谢物的标
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的相关操作，检测IL-6、TNF-α水平。 准 。结果以火山图（差异倍数的对数 log2差异倍数为
2.4 血样采集及处理 横坐标，Q 值的负对数－log10Q 为纵坐标）形式呈现，表
末次给药结束后，各组大鼠禁食 24 h，然后以乙醚 示其同一类样本间的重复性是否良好。
麻醉，于眼眶后静脉丛取血3 mL至离心管中，室温静置 2.6.2 潜在生物标志物通路分析 通过查找相关文献
1 h，待凝固分层后，在 4 ℃下以 12 000 r/min 离心 10 资料 [12-18] ，找出差异性代谢物中与 COPD 疾病相关的潜
min，取上清液，备用。 在生物标志物。为研究潜在生物标志物所涉及的代谢
2.5 LC-MS法检测大鼠血清中的代谢产物 途径及各潜在生物标志物之间的相互作用关系，利用
2.5.1 色谱与质谱条件 （1）色谱条件。色谱柱为 MetPA 分析平台（https：//www.metaboanalyst.ca/）对最终
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ZORBAX Eclipse Plus C18 （100 mm×2.1 mm，3.5 μm）；正 得到的潜在生物标志物进行代谢通路富集分析 。将
离子流动相为含0.1％甲酸的水溶液（A）-乙腈（B）；负离 血清中的潜在生物标志物导入 MetaboAnalyst 4.0 软件
子流动相为含5 mmol/L乙酸铵的水溶液（A）-乙腈（B）； 分析，横坐标为代谢通路影响值，纵坐标为－log10P，表
柱温为50 ℃；流速为0.5 mL/min；进样体积为2 μL。正、 示得到的代谢通路富集分析的显著性水平。横、纵坐标
负离子梯度洗脱条件均为 0～1 min，2％B；1～13 min， 值越大，颜色越深，圆圈越大，则与代谢通路的相关性越
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2％B→90％B；13～16 min，90％B；16～16.1 min，90％B→ 大 。
2％B；16.1～20 min，2％B。（2）质谱条件。样品质谱信 2.7 统计学方法
号采集分别用正、负离子模式扫描模式，毛细管电离电 采用SPSS 19.0软件进行数据分析。各项指标结果
压为 3.0 kV；取样锥孔电压为 27 eV；萃取锥孔电压为 4 采用x±s表示，对数据进行正态性检验及方差齐性检验
eV；离子源温度为120 ℃；脱溶剂温度为500 ℃；脱溶剂 后使用单因素方差分析，组间两两比较采用 Dunnett 或
氮气流速为600 L/h；锥孔反吹氮气流速为50 L/h。 Dunnett’s T3方法。P＜0.05表示差异有统计学意义。
2.5.2 样品的制备与检测 吸取血清样品 40 μL 加入 3 结果
96 孔板中，再加入甲醇 120 μL，封膜后振荡 1 min，置 3.1 大鼠肺泡灌洗液中IL-6、TNF-α水平的测定结果
于－20 ℃冷冻 30 min 后，在 4 ℃下以 4 000 r/min 离心 与正常组比较，模型组大鼠肺泡灌洗液中 IL-6、
20 min。吸取上清液 25 μL 至 96 孔板中，加入 225 μL TNF-α水平显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，盐酸班
50％甲醇稀释，混合均匀，按“2.5.1”项下色谱与质谱条 布特罗组大鼠肺泡灌洗液中 TNF-α、IL-6 水平显著降低
件进样分析。 （P＜0.05），详见表1。
2.6 数据采集与分析 表 1 各组大鼠肺泡灌洗液中 IL-6、TNF-α水平的测定
2.6.1 差异代谢物的筛选及鉴定 为了区分正常组与 结果（x±±s，n＝6，pg/mL）
模型组、模型组与盐酸班布特罗组血清样品中代谢物之 Tab 1 The levels of IL-6 and TNF-α in BALF of rats
间的差异，减少与研究目的不相关的生物学差异和样本 in each group（x±±s，n＝6，pg/mL）
处理分析过程中的偏差，本文采用正交偏最小二乘判别 组别 IL-6 TNF-α
分 析（OPLS-DA）。 将 LC-MS 数 据 文 件（.raw）使 用 正常组 145.85±18.64 92.54±3.94
模型组 172.77±4.05 ＊ 103.29±1.92 ＊
MasslynxV 4.1数据软件转换为开放数据格式文件（.csv）， 盐酸班布特罗组 158.08±8.70 # 91.55±5.71 #
得到保留时间、质荷比（m/z）、峰面积的数据矩阵后，导 注：与正常组比较，P＜0.05；与模型组比较，P＜0.05
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＊
入 SIMCA-P 14 软件进行代谢组学分析。分别对正、负 Note：vs. normal group，P＜0.05；vs. model group，P＜0.05
＊
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·566 · China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 5 中国药房 2020年第31卷第5期