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对形成的生物膜染色15 min。弃去染料，用无菌PBS冲 培养箱中培养 24 h。离心，收集上清液，按照 LDH 试剂
洗 2 次，干燥后每孔加入 100 μL 95％乙醇溶液，溶解已 盒说明书操作测定LDH活力。
被染色的生物膜上的结晶紫。采用酶标仪于 540 nm 波 2.9 统计学方法
长处测定其OD值，并计算细菌生物膜存活率：细菌生物 采用SPSS 12.0软件对试验数据进行统计分析。计
膜存活率（％）＝1－[（1－OD 给药组/OD 阴性对照组 ）×100％]。 量资料以x±s表示，采用单因素方差分析的Dunnett（双
2.6 变异链球菌细菌生物膜结构的观察 侧）检验进行组间比较。P＜0.05为差异有统计学意义。
采用激光扫描共聚焦显微镜进行观察。按 500 3 结果
μL/皿的量将菌悬液加入激光扫描共聚焦专用培养皿 3.1 抑菌圈测定结果
中，设置鞣花酸组（1/2MIC）和阴性对照组（5％DMSO溶 结果显示，5％DMSO 作为溶剂对变异链球菌的生
液），每组设置3个平行皿，每皿加入500 μL相应样品溶 长无明显变化。12.5～50 mg/mL 鞣花酸对变异链球菌
液，置于 37 ℃培养箱中培养 24 h 后，吸弃上清液，以无 产生了抑菌圈，且抑菌圈的直径随着药物质量浓度的增
菌PBS洗去浮菌，用2％甲基纤维素固定后，加入制备好 加而增大，其中 50 mg/mL 鞣花酸对变异链球菌抑菌圈
的活/死细菌荧光染料 20 μL[按说明书将试剂盒中荧光 的大小与复方氯己定含漱液相近，对变异链球菌均为高
染色剂SYTO9和碘化丙啶（PI）按照 1 ∶ 1（V/V）的比例混 度敏感。抑菌圈直径测定结果见表1。
合溶于适当体积的无菌水中]，室温下避光孵育 20 min， 表1 抑菌圈直径测定结果（x±±s，n＝3，mm）
然后立即在激光扫描共聚焦显微镜下观察。活菌被SY- Tab 1 Diameter of bacteriostatic ring（x±±s，n＝3，mm）
TO9染色后发出绿色荧光，死菌被PI染色后发出红色荧 鞣花酸，mg/mL 5％DMSO 复方氯己
组别
光，SYTO9 和 PI 染色叠加图中黄色表示活菌和死菌重 50 25 12.5 6.25 3.125 1.562 5 溶液 定含漱液
鞣花酸组 22.33±0.735 19.30±0.405 15.40±0.662 / / /
叠处。 阴性对照组 /
2.7 变异链球菌中EPS生成情况考察 阳性对照组 22.40±0.56
采用苯酚硫酸法进行测定。按 500 μL/管的量将菌 注：“/”表示无抑菌圈形成
悬液加入无菌离心管中，以5％DMSO溶液为阴性对照， Note：“/”means no bacteriostatic ring
3.2 MIC和MBC测定结果
考察不同质量浓度（1/8MIC、1/4MIC、1/2MIC、MIC）鞣
结果显示，鞣花酸对变异链球菌的 MIC 为 12.5
花酸对变异链球菌中 EPS 生成的影响，每个样品设置 3
mg/mL、MBC为25 mg/mL，表明鞣花酸对变异链球菌有
个平行管，每管中加入 5 mL 相应样品溶液，然后置于
抑制作用。
37 ℃培养箱中培养16 h。在4 ℃条件下以5 000 r/min离
3.3 细菌生物膜存活率的测定结果
心20 min（下同），收集上清液；用无菌蒸馏水重悬沉淀
结果显示，不同质量浓度鞣花酸作用后，变异链球
并再次离心，收集上清液，合并2次上清液（含有水溶性
菌生物膜存活率较阴性对照组均显著降低（P＜0.01），
EPS）。然后加入 0.1 mol/L NaOH 溶液 5 mL 重悬沉淀，
且呈明显剂量依赖趋势。在MIC浓度下，变异链球菌生
离心2次，收集上清液（含有水不溶性EPS）。以0.22 μm
物膜的存活率仅为（16.41±1.346）％。细菌生物膜存活
的滤膜分别过滤以上2种上清液，各取适量分别加入3倍
率测定结果见图1。
量冷却的 95％乙醇溶液，4 ℃过夜以沉淀 EPS。次日再
次离心，弃水相，沉淀物分别加入5 mL蒸馏水和5 mL 0.1 120
％ 100
mol/L NaOH 溶液溶解。取上述含 2 种 EPS 的溶液各 1 80 ＊＊
mL，分别加入5％冰苯酚1 mL，摇匀，迅速加入浓硫酸5 细菌生物膜存活率， 60 ＊＊
mL，摇匀，放置 5 min 后，放入沸水浴中反应 15 min 后， 40 ＊＊
冷却到室温。采用紫外分光光度仪于490 nm波长处测定 20 ＊＊
其OD值，并分别计算水溶性EPS和水不溶性EPS的抑制 0 阴性对 1/8MIC 1/4MIC 1/2MIC MIC
率：EPS抑制率（％）＝（1－OD 给药组/OD 阴性对照组 ）×100％。 照组 鞣花酸组
2.8 变异链球菌细胞外基质中LDH活力的测定 注：与阴性对照组比较， P＜0.01
＊＊
＊＊
采用还原型辅酶Ⅰ氧化法进行测定。使用96孔板， Note：vs. negative control group， P＜0.01
图1 细菌生物膜存活率测定结果
按 100 μL/孔加入菌悬液和等量的 BHI 液体培养基后，
Fig 1 Result of survival rate of bacterial biomembrane
置于 37 ℃培养箱中培养 24 h。弃去上清液，沉淀用无
菌 PBS 缓冲液清洗 2 次。设置鞣花酸不同质量浓度组 3.4 细菌生物膜结构的观察结果
（1/8MIC、1/4MIC、1/2MIC、MIC）和 阴 性 对 照 组（5％ 染色结果显示，阴性对照组中细胞互相黏附聚集形
DMSO 溶液），每组设置3个平行孔，在清洗过的培养孔 成团块，主要呈绿色荧光，表示多为活菌，细菌生物膜结
（含有沉淀）中加入 200 μL 相应样品溶液后，置于 37 ℃ 构完整。鞣花酸组中，多呈红色荧光，表明经1/2MIC鞣

中国药房 2020年第31卷第5期 China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 5 ·609 ·