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龋病是一种口腔内多因素疾病，与心血管疾病、癌症                         菌蒸馏水。
        一起被列为人类三大重点防治的慢性非传染性疾病 。                            1.3 菌种
                                                      [1]
        虽然龋病的病程发展较为缓慢，但是其发病率高、流行                                变异链球菌标准菌株（ATCC 700610）由新疆医科大
        区域广泛，不容忽视。细菌的存在是龋病发生的基础，                            学中心实验室提供。
        而牙菌斑生物膜是龋病发生所依赖的微环境 。变异链                            2 方法
                                               [2]
        球菌是目前公认的主要致龋菌群，常黏附于牙面形成生                            2.1 菌悬液的制备
                       [3]
        物膜而导致龋病 。糖代谢是变异链球菌致龋的重要途                                取常规复苏的变异链球菌标准菌株接种于 BHI 液
        径：变异链球菌以蔗糖为底物，可以合成细菌胞外多糖                            体培养基中，于 37 ℃培养箱中培养 24 h 后，取菌液在
        （EPS），而合成 EPS 和形成生物膜的能力是其经典毒力                       BHI 板上划线培养 24 h，然后挑取单菌落在 BHI 液体培
        表型，这些毒力因子在变异链球菌致病过程中发挥着重                            养基中以同样条件纯培养。待细菌进入对数生长期后，
              [4]
        要作用 。                                               用紫外分光光度计调整菌液浓度约 10 CFU/mL[在 630
                                                                                             7
            目前，抗生素、氟化物以及免疫防龋等的使用已被                          nm波长处的吸光度（OD）为0.2]，备用。
        证明能有效地抑制口腔内的致龋菌，但这些方法存在会                            2.2 抑菌圈的测定
                                           [5]
        产生耐药性或致使口腔菌群失调等问题 。而天然产物                                采用打孔法抑菌试验进行抑菌圈测定。将鞣花酸
        因其毒副作用小的优势，逐渐成为防龋药物研究开发的                            对照品用5％二甲基亚砜（DMSO）溶液溶解后制成质量
        热点 。鞣花酸作为一种多酚二内酯成分，是没食子酸                            浓度为 50 mg/mL 的母液；再用 BHI 液体培养基将母液
             [6]
        的二聚衍生物，存在于许多水果（如覆盆子、石榴等）及                           按二倍稀释法稀释成鞣花酸质量浓度分别为 25、12.5、
        药用植物（如五倍子、地榆等）中 。鞣花酸因具有多种                           6.25、3.125、1.562 5 mg/mL 的药液。取 100 μL 菌悬液
                                    [7]
        生物活性（如抗氧化、抗癌、抗突变、抑制溃疡、抑制人体                         （10 CFU/mL，下同）均匀涂布在 BHI 平板上，再以打孔
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        免疫缺陷病毒等）而受到广泛关注               [8-9] 。近年来，许多多        器打孔。设置鞣花酸不同质量浓度组（1.562 6～50
        酚类化合物（如茶多酚、厚朴酚等）被证实具有广谱的抑                           mg/mL）、阴性对照组（5％DMSO）和阳性对照组（复方
                                              [10]
        菌效果，且对口腔致龋菌有良好的抑制作用 。鞣花酸                            氯己定含漱液），每组重复设置3个孔，每孔中加入20 μL
        作为一种天然的多酚类成分，国内外对其抑菌作用，特                            相应样品溶液，然后于 37 ℃培养箱中培养 24 h。取出
        别是其对口腔致龋菌的抑制作用及机制的研究报道相                             后，以十字交叉法测定抑菌圈直径，取平均值。结果判
        对较少。因此，本研究以鞣花酸为研究对象，通过考察                            定按《药理实验方法学》标准 ：抑菌圈直径＜10 mm 为
                                                                                     [11]
        对口腔主要致龋菌——变异链球菌的生长、细菌生物膜                            无抑菌活性，10 mm 为轻度敏感，11～15 mm 为中度敏
        形成等毒力因子的影响，探索其在防治龋病方面的开发                            感，16～20 mm为高度敏感。
        应用潜力。                                               2.3  最小抑菌浓度的测定
        1 材料                                                    使用96孔板，按100 μL/孔加入菌悬液，设置鞣花酸
        1.1  仪器                                             不同质量浓度组（50、25、12.5、6.25、3.125、1.562 5 mg/mL）、
            C2 型激光扫描共聚焦显微镜（日本 Nikon 公司）；                    阴性对照组（5％DMSO 溶液）和阳性对照组（复方氯己
        311 型二氧化碳培养箱（美国 Thermo 公司）；752 型紫外                  定含漱液），每组重复设置 3 个孔。每孔中加入 100 μL
        分光光度计（上海菁华科技仪器有限公司）；4K15 型冷                         相应样品溶液，然后37 ℃培养箱中培养24 h。每孔中加
        冻离心机（美国 Sigma 公司）；LDZX-75KBS 型高压蒸汽                  入刃天青染色剂（1 mg/mL）20 μL，4 h后观察，由蓝色变
        灭菌锅（上海申安医疗器械有限公司）；SMP500 型酶标                        为粉色的药物浓度即为最小抑菌浓度（MIC）。
        仪（德国Spectro Max公司）。                                 2.4 最小杀菌浓度的测定
        1.2 药品与试剂                                               根据MIC值测定结果，选择药液浓度≥MIC的各孔
            复方氯己定含漱液（江苏晨牌邦德药业有限公司，                          菌悬液，分别划线于BHI平板上，将平板置于37 ℃培养
        批号：201810232，规格：500 mL，含葡萄糖酸氯己定 0.6                 箱中培养24 h，观察无可见菌落生长的最低浓度即为最
        g、甲硝唑0.1 g）；鞣花酸对照品（中国食品药品检定研究                       小杀菌浓度（MBC）。
        院，批号：111959-201802，纯度：≥98％）；脑心浸肉汤                   2.5 变异链球菌细菌生物膜形成情况考察
        （BHI）培养基（批号：1226L031）、刃天青染色剂（批号：                        采用结晶紫染色法进行测定。使用96孔板，按100
        512C031）均购自北京索莱宝科技有限公司；活/死细菌                        μL/孔加入菌悬液，设置鞣花酸不同质量浓度组（1/8MIC、
        染色试剂盒（货号：L13152）、磷酸盐缓冲液（PBS，批号：                     1/4MIC、1/2MIC、MIC）、阴性对照组（5％DMSO 溶液），
        NXL0739）均购自赛默飞世尔生物化学制品（北京）有限                        每组重复设置 3 个孔，每孔加入 100 μL 相应样品溶液，
        公司；乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒（中国南京建成生物工                          然后置于 37 ℃培养箱中培养 24 h 后，吸弃上清液。沉
        程公司，批号：20181025）；其余试剂均为分析纯，水为灭                      淀用无菌 PBS 轻轻洗涤 2 次，加入 100 μL 0.1％结晶紫，


        ·608  ·  China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 5                                   中国药房    2020年第31卷第5期
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