Page 91 - 2020年2月第31卷第3期
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青素-3-葡萄糖苷+LM22B-10），每组30只。单药组和激                    用2  －ΔΔc t 法计算目的基因的相对表达量。
        动剂联用组小鼠均于造模前灌胃 600 μg/kg 桑椹花青                      2.6 小鼠海马组织中BDNF蛋白表达检测
        素-3-葡萄糖苷，每日给药 1 次，连续给药 6 周；在此基                         采用 Western blotting 法进行检测。取“2.5”项下小
        础上激动剂联用组小鼠于造模前1周开始给予LM22B-                         鼠海马组织，加入蛋白裂解液 80 mL，冰浴上超声匀浆
        10，侧脑室注入，每次5 mg/kg，每日给药1次，连续给药1                    （40 kHz、10 s/次，连续 5～6 次，每次间隙 30 s），然后以
          [6]
        周 。同时，正常组、模型组小鼠灌胃等体积生理盐水。                          13 000 r/min 离 心 15 min，取 上 清 ，进 行 二 喹 啉 甲 酸
        给药结束后，除正常组外，其余各组小鼠均复制癫痫模                           （BCA）蛋白定量。取蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯
        型：小鼠先腹腔注射新鲜配制的氯化锂溶液（180 mg/kg），                    酰胺（SDS-PAGE）凝胶电泳，再转移至硝酸纤维素膜
        24 h后腹腔注射东莨菪碱（1 mg/kg），15 min后再腹腔注                 （PVDF 膜），以脱脂牛奶封闭 2 h 后，加入 BDNF、GAP-
                                [8]
        射盐酸匹罗卡品（30 mg/kg） 。根据Racine分级进行癫                   DH一抗（1 ∶ 1 000），4 ℃孵育过夜；以TBST缓冲液洗膜
                  [9]
        痫发作评定 ，30 min 后未出现癫痫发作的小鼠重复腹                       4次，每次20 min，再加入相应二抗（1 ∶ 2 000），室温孵育
        腔注射盐酸匹罗卡品（10 mg/kg），直至诱导癫痫发作。                      2 h；以TBST缓冲液漂洗3次，每次10 min。漂洗结束后
        2.3 小鼠癫痫行为分析及脑电图监测                                 加入化学发光液，采用超灵敏多功能生物分子成像仪采
            造模结束后，各组分别取 10 只小鼠，通过动物行为                      集BDNF和GAPDH条带并拍照，图片采用Gel-Pro Ana-
        学研究试验仪观察并记录其癫痫自发性再发作行为。                            lyzer 4.5 软件进行灰度值分析，以目的蛋白条带灰度值
        自造模成功后，每天观察 6 h（上午 9：00－12：00，下午                   与内参GAPDH条带灰度值的比值表示目的蛋白的相对
        2：00－5：00），连续观察4周，记录癫痫自发性再发作的                      表达量。
        潜伏期（h）、平均发作频率（次/d）和发作持续时间（s）。                      2.7 统计学方法
        同时自造模成功后第 14、28、36 天对各组小鼠进行脑电                          采用SPSS 19.0统计学软件进行统计分析。计量资
        图检查，每次检测1 h，记录单位时间内异常脑电波发生                         料以 x±s 表示，组间比较采用单因素方差分析和 t 检
        次数。脑电图诊断标准参照冯应琨的《临床脑电图学》                           验。P＜0.05表示差异有统计学意义。
        及周昌贵的《临床脑电图手册》，以脑电图出现弥漫性异                          3 结果
        常、局灶性异常、阵发性节律波及异常波发放和高峰矢                           3.1  各组小鼠癫痫自发性再发作的发生情况
        律等为异常脑电图。                                              经造模后，模型组小鼠发生癫痫。与模型组比较，
        2.4  小鼠血清钙离子水平检测                                   单药组小鼠癫痫自发性再发作的潜伏期显著延长，发作
            于造模成功后第6天，各组随机取10只小鼠尾静脉                        频率显著降低（P＜0.05），发作持续时间显著缩短（P＜
        取血，分离血清，按MTB试剂盒说明书检测小鼠血清中                          0.05），这提示桑椹花青素-3-葡萄糖苷对模型小鼠癫痫
                                                           的发作具有一定的抑制作用。与单药组比较，激动剂联
        钙离子水平。
                                                           用组小鼠癫痫自发性再发作的潜伏期显著缩短（P＜
        2.5  小鼠海马组织中BDNF mRNA表达检测
                                                           0.05），发作频率显著升高（P＜0.05），发作持续时间显著
            采用实时荧光定量-PCR法进行检测。既往文献研
                                                           延长（P＜0.05）。各组小鼠癫痫自发性再发作的潜伏
        究结果表明，BDNF蛋白表达在造模成功后6～7天达到
                                                           期、发作频率和发作持续时间测定结果见表1。
        高峰 。因此，本研究在造模成功后的第6天，各组随机
            [6]
                                                           表 1   各组小鼠癫痫自发性再发作的潜伏期、发作频率
        取 10 只小鼠处死并取出海马组织，按 RNA 提取试剂盒
                                                                 及持续时间测定结果（x±±s，n＝10）
        说明书对小鼠海马组织中的mRNA进行提取，验证其纯
                                                           Tab 1 Determination results of latency，frequency
        度后反转录合成 cDNA，以合成的 cDNA 为模板进行
                                                                   and duration of epilepsy seizure of mice in
        PCR 扩 增 。 BDNF 上 游 引 物 序 列 为 5′-AGTGTGT-
                                                                   each group（x±±s，n＝10）
        CATAGAGCTTCCTGTTTCATCTCCCAGT-3′，下 游 引
                                                           组别              潜伏期，h       发作频率，次/d   发作持续时间，s
        物 序 列 为 5′-TGGAACCAGGCCCCAGGGAATCTT-
                                                           正常组             0           0          0
        TCAGCTGCATT-3′，扩增片段长度为 533 bp；GAPDH                模型组             16.22±6.21 ＊  3.3±1.10 ＊  57.03±15.12 ＊
        上游引物序列为5′-GGGAGCCAAAAGGGTCAT-3′，下                  单药组             28.73±5.69 #  1.5±0.56 #  34.13±16.91 #
                                                           激动剂联用组          18.63±4.91 Δ  2.9±1.03 Δ  49.60±15.64 Δ
        游引物序列为 5′-GAGTCCTTCCACGATACCAA-3′，扩
                                                                            ＊
                                                               注：与正常组比较，P＜0.05；与模型组比较，P＜0.05；与单药组
                                                                                              #
        增 片 段 长 度 为 452 bp。 反 应 体 系 总 体 积 为 25 μ L。
                                                               Δ
                                                           比较，P＜0.05
        BDNF 反应条件：94 ℃预变性 3 min；94 ℃变性 30 s，                   Note：vs. normal group， P＜0.05；vs. model group，P＜0.05；vs.
                                                                               ＊
                                                                                                  #
        56 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 30 s，30 个循环；72 ℃再延伸             single medication group，P＜0.05
                                                                            Δ
        5 min。GAPDH 反应条件中的退火条件为 58 ℃反应 1                   3.2 各组小鼠脑电图异常情况观察结果
        min，其余条件均与 BDNF 相同。以 GAPDH 为内参，采                       在造模成功后第14、28、36天，模型组小鼠异常脑电
        中国药房    2020年第31卷第3期                                               China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 3  ·337  ·
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