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合成多肽药物分子则更需要在氨基酸组成分析、氨基酸                           （Gln）会经酸催化脱氨而发生水解；而在 pH＞7 时，Gln
        序列分析、二硫键分析等方面进行结构确证研究。                             不易形成六元环，更加稳定。
        1.2.1  分子量测定      同化学原料药一样，合成多肽药物                  1.2.3  氨基酸序列分析         与其他分子一样，化学成分的
        的结构确证中也包括分子量的测定，一般采用质谱法                            阐明是确定肽同一性的基础，包括阐明氨基酸及其在肽
        进行单同位素质量的测定，其质量偏差应在理论值                             链中的排列顺序，即一级结构/序列。传统氨基酸测序方
                                                           法为 Edman 降解法，但该方法一般用来测定 N 端氨基
        的±1.0 个质量单位内；对于分子量在 2 kDa 以上的多
                                                           酸；此外，Edman 测序和串联质谱相结合也是目前常用
                                   [16]
        肽，使用高分辨质谱仪更为合适 。
                                                           的一种方法，可用于阐明含有二硫键的复杂肽，例如降
        1.2.2  氨基酸组成分析         氨基酸组成分析可说明多肽
                                                                              [17]
                                                           钙素鲑鱼的一级结构 。采用串联质谱法测定肽序列
        的组成是否正确，不仅能证明多肽的结构，还能在一定
                                                           时通常使用碰撞诱导解离（CID）碎裂技术，但如果序列
        程度上反映样品的纯度（是否含有合成杂质）。在进行
                                                           覆盖度差，应考虑采用其他的质谱碎裂技术                    [18-23] （见表
        氨基酸组成分析时，要注意考察所涉及的各类氨基酸，                           1）。对于含有 20 个以上氨基酸残基的长肽，如不能直
        尤其是非天然氨基酸和氨基酸衍生物的色谱行为，以准                           接确定其序列，可进行多肽肽图的分析，分析过程一般
        确进行定性、定量分析。此外，在该项分析当中应建立                           是用专一性较强的蛋白水解酶（一般为肽链内切酶）对
        合适的水解方法，因为不同的水解条件可能会对某些氨                           多肽进行水解，再用液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）
        基酸的回收产生较大影响 ，如 pH＜3 时，谷氨酰胺                         确定各肽段。
                                [17]
                                         表1 生物质谱中重要的质谱碎裂技术
        质谱碎裂技术                   主要产生的离子类型       常用质谱分析器                                 适用范围
        低能CID                    b型和y型离子
                                                 通用型质谱仪                      氨基酸序列长度较短的、带2个或3个电荷为主的肽段
        高能CID                    所有的序列特征离子
        高能碰撞解离技术（HCD）            b型和y型离子         轨道离子阱质谱仪                    被广泛用于蛋白质翻译后修饰的研究
        基于电子诱导的电子捕获解离技术（ECD）     c型和z型离子         傅里叶变换离子回旋共振质谱仪（FT-ICR-MS）
                                                                             氨基酸序列长度较长的、带3个及以上电荷为主的肽段
        电子转移解离技术（ETD）            c型和z型离子         离子阱型的质谱仪
        1.2.4  二硫键分析      正确的二硫键数目和位置是多肽                   GC α2H ）及通过link连接的异源二聚血红素结构域蛋白
        和蛋白质产生生物活性的结构保证，在对合成或天然多                           （hsGC β1H-2H ）中α螺旋结构的含量相对较高，但其重组
        肽产品研究的过程中，二硫键的分析是需要考察的重要                           后α螺旋结构含量有所降低，β折叠结构相对升高，这一
        内容之一。合成多肽药物分子中如含有二硫键，一般先                           发现与CD法测得的结果相近。
        采用还原试剂如二硫代硫醇（DTE）、二硫苏糖醇（DTT）                           结合目前已有合成多肽药物结构确证的相关技术
        或三（2-羧乙基）膦（TCEP）对这类药物进行还原，然后进                      指导原则以及有关研究文献，合成多肽药物结构表征的
        行质谱分析，通过比较还原前后的质量差可确定其含有                           主要内容有分子量测定、氨基酸组成和序列分析、二硫
        的二硫键数目。其中，对含有多对二硫键的多肽还应该                           键分析以及二级结构分析等，具体的研究内容可结合研
        对其二硫键进行定位分析。部分还原是一种被广泛接                            究对象的具体结构而有所侧重。
        受的定位二硫键的方法，在这种方法中，多肽在可控的                           2 串联质谱法在合成多肽药物结构确证中的应用
        条件下被消解，从而使不同还原动力学的二硫键被还                                串联质谱是时间上或空间上两级以上质量分析的
        原，再经串联质谱分离和分析，即可完成二硫键的定位。                          结合，用以测定第一级质量分析器中的前体离子（Pre-
        1.2.5  二级结构分析       含有 40 个氨基酸以上的肽通常               cursorion）与第二级质量分析器中的产物离子（Produc-
        表现出高度的构象灵活性，其特征主要是随机螺旋和一                           ticm）之间的质量关系 。软电离技术的发展和采用新
                                                                               [27]
        定程度的二级结构（如α螺旋和/或β折叠）。结构的有序                         技术的质量分析器的研发，进一步推动了串联质谱在多
                                           [24]
        性可能对某些肽的生物活性有重要影响 ，因此二级结                           肽药物结构确证方面的研究应用。
        构的阐明也是多肽结构表征的一部分。一般常用圆二                            2.1 串联质谱法在合成多肽药物结构确证方面的应用
        色谱（CD）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、核磁共振                        2.1.1  常规电喷雾离子源串联质谱法（ESI-MS/MS）
       （NMR）、X 射线晶体学、拉曼光谱和荧光光谱等方法对                           在电喷雾质谱中，肽段经惰性气体碰撞而诱导裂解可
        多肽药物的二级结构进行分析。例如，阮进成等 通过                           产生稳定的N端系列a、b、c型离子和/或C 端系列x、y、z
                                                  [25]
        体外折叠体系折叠化学合成抗菌肽 Plectasin，经过高效                     型离子（主要是b、y型离子），根据碎片离子间的质量差
                                                                                       [28]
        液相色谱（HPLC）分离纯化之后采用 CD 进行二级结构                       可以推断出多肽的氨基酸序列 。相比于 Edman 降解
        鉴定，发现未折叠分子只具有α螺旋结构，外折叠的Plec-                       测序法，ESI-MS/MS可用于分析N端封闭和经修饰的多
                                                                          [30]
                                                              [29]
                                              [26]
        tasin 具有α螺旋及反平行β折叠结构。高铮亚 采用FT-                     肽 。周红华等 应用电喷雾质谱法（ESI-MS）及源内
        IR 法研究了可溶性鸟苷酸环化酸血红素结构域蛋白质                          CID对胸腺五肽（TP5，人工合成五肽）进行测定，得到质
                                                                                 +
                                                                                                      +
        的二级结构，发现在亚基单独的血红素结构域蛋白（hs-                         荷比（m/z）680.3 的[M+H] 峰，m/z 702.2 的[M+Na] 峰等
        中国药房    2019年第30卷第20期                                            China Pharmacy 2019 Vol. 30 No. 20  ·2877  ·
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