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相关加和峰，这些数据与 TP5 的理论相对分子质量                           曲肽中存在一对二硫键。在一级质谱图中确定完全打
        679.4 相符；并得到了 TP5 的系列碎片离子（主要是 b 型                   开二硫键之后，选定了 m/z 511.21 的双电荷峰进行二级
        离子），通过解析碎片离子，最终确定了其氨基酸序列                            质谱分析，通过调节合适的碰撞能量得到了系列碎片离
        （从 N 端到Ｃ端）为：精氨酸-赖氨酸-天冬氨酸-缬氨酸-                       子峰，借助相关软件标识出y型离子，解析后最终确定了
        酪氨酸（RKDVY）。周红华等             [31] 的另一项研究应用           奥曲肽一级结构的氨基酸序列。梁艳等                     [38] 利用 Na-
        ESI-MS 及源内 CID 技术对多肽类药物醋酸亮丙瑞林                       no-ESI-MS/MS通过全扫描模式测得阿托西班还原前样
                                                                    +
        （人工合成九肽）进行了测定，结果测得其分子量与理论                           品[M+H] 离子峰的m/z为994.448 7，与理论值994.449 0
        值一致；并通过分析得到的b、y型碎片离子，证实了亮丙                          的相对偏差为0.4×10 ，从而确认阿托西班样品的分子
                                                                              －6
                                                                                                      +
                                   [32]
        瑞林的氨基酸序列。周红华等 又应用ESI-MS及源内                          量是正确的；使用 DDT 还原后测得样品[M+H] m/z 为
        CID 技术分析了曲普瑞林（人工合成十肽）和促黄体素                          996.4，还原前后的质量差为 2 Da，确定该样品中存在 1
        释放激素类似物（人工合成九肽）的氨基酸序列，结果，                           对二硫键；在确定阿托西班的二硫键完全打开后，选
        这两种寡肽在正离子模式下均可得到较好的质谱信息，                            择了 m/z 498.73 的双电荷峰为母离子进一步进行 ESI-
                                                +
                                       +
        且均得到了其准分子离子峰[M+H] 及[M+Na] 信号峰，                      MS/MS分析，通过y型离子解析二级质谱图后确定了阿
        分子量分别与各自理论值一致；又通过分析得到的一系                            托西班一级结构的全序列并对其4个修饰位点（分别位
        列典型的b、y型碎片离子，从而确证了这两种寡肽的一                           于N端、C端和侧链上）进行了确证。结果表明，该方法
                         [33]
        级结构。张冬梅等 采用电喷雾-四极杆-飞行时间串联                           灵敏度高、速度快，在多肽类药物一级结构分析方面具
        质谱法（ESI-Q-TOF-MS/MS）测定了磷酰化修饰后的 5                    有独特的优势。
        种模型肽的氨基酸序列，该方法很好地区分了 m/z相近                          2.1.3  基质辅助激光解吸-飞行时间串联质谱法（MAL-
        的赖氨酸和谷氨酰胺氨基酸残基，提高了质谱测序的准                            DI-TOF/TOF-MS） MALDI-TOF/TOF-MS 具有样品不
        确度。                                                 易碎裂、分子离子峰强等明显优点，可快速测定生物大
            既往研究显示，环孢菌素类化合物（环状十一肽）的                         分子和高分子的分子量，在生物学等领域应用广泛 。
                                                                                                         [39]
                                                                          [40]
        氨基酸序列信息丰富、差异性大，可利用 ESI-MS/MS 对                      例如，桑志红等 应用 MALDI-TOF-MS 测得使用 DDT
        该类化合物进行快速的初步鉴定。例如，陈振伟等 应                            还原后的重组蛋白纽兰格林（rhNRGL）准分子离子峰[M+
                                                    [34]
        用电喷雾离子化多级质谱法分析了 CsA、CsB、CsC、                        H] m/z为7 051.185 5，与其理论值的偏差为5.57×10 ；分
                                                                                                       －6
                                                              +
        CsD 4 种环孢菌素同系物，在 m/z 50～1 400 范围内进行                 别选择m/z为880.538、1 043.617、1 277.732 的碎片离子作
        多级扫描，分别得到了这4个样品的三级质谱图。其中，                           为母离子，设定离子门窗口为 6 Da，调节合适的质谱参
                                              +
        一级质谱图中主要是这4种同系物的[M+H] 分子离子，                         数，使用 BioTools 软件分析二级质谱图，并手动及自动
                                       +
        二级和三级质谱图中主要是[M+H] 经 CID 得到的一系                       标注氨基酸序列，确证了重组蛋白纽兰格林C 端序列的
        列碎片离子（以b型离子为主）。对比分析所得质谱图发                           10个氨基酸序列。
        现，这 4 种环孢菌素同系物主要裂解位点在 2-3 位间、                       2.1.4  多种方法结合        肽类药物一般要经过合理的化
                                           +
        1-11 位间、5-6 位间；而分析[M+H－H2O] 峰可以进一步                  学修饰，以最大限度地提高其稳定性和生物利用度，同
        确定环孢菌素中的氨基酸序列。该研究表明，该方法简                            时保持甚至提高生物活性肽的作用和选择性，这也给串
        便、准确，可用于这类化合物的快速鉴别。方剑英等 应                           联质谱法的测序带来了一定的困难，所以有时需要综合
                                                    [35]
                                                                                                  [41]
        用 ESI-MS/MS 分析了 9 个环孢菌素类化合物经强酸水                     使用多种技术进行结构确证。例如，薛燕等 使用DTT
        解后的产物，获得了这9个化合物一些组成氨基酸的特                            还原重组人纽兰格林（rhtNRGL）中的二硫键，采用四极
        征分子离子峰，结果发现1位上特殊的氨基酸的分子离                            杆-傅里叶变换离子回旋共振串联质谱法（Q-FT-MS/
        子峰特征明显。该研究表明，与已知的方法相比，该方                            MS）测定rhtNRGL还原前后的精确相对分子量，计算质
        法可在无对照品的情况下，快速准确地鉴别环孢菌素类                            量差，从而确定了分子中的二硫键数目；采用 MAL-
        化合物。                                                DI-TOF/TOF-MS 测定 rhtNRGL 的 N 端的 5 个氨基酸序
        2.1.2  纳升电喷雾串联质谱（Nano-ESI-MS/MS） 常规                 列；采用 ESI-MS/MS 测定 rhtNRGL 的 C 端的 11 个氨基
        电喷雾技术的耗样量大，而纳升电喷雾技术因其喷雾头                            酸序列；采用Tyrsin和Glun-C两种蛋白酶对样品进行酶
        口径小，使得样品分子的去溶剂化和离子化效率大大提                            解后，经 MALDI-TOF-MS 检测获得该样品的肽质量指
        高，故其已经越来越广泛地运用于生物大分子的分析                             纹图谱，计算得到两种酶切肽谱的序列覆盖率分别为
                        [37]
               [36]
        鉴定中 。李萍等 加入还原剂DTT将奥曲肽（人工合                           82％和 64％，经过分析确证主成分二硫键配对正确，同
        成八肽）中的二硫键打开，采用Nano-ESI-MS/MS测得还                     时发现少量错配二硫键异构体。依替巴肽 N 端是脱氨
        原前奥曲肽相对分子量为1 019.450 2，与理论分子量的                      基半胱氨酸，用串联质谱法测定其氨基酸序列时存在一
        相对误差为 1.9 ppm；测得还原后奥曲肽相对分子量为                        定的困难，为此厉保秋等 采用ESI-MS/MS证实了依替
                                                                                 [42]
        1 021.456 7，还原前后的相对质量差为2 Da，由此确定奥                   巴肽的相对分子量及肽链环化结构，结合核磁共振氢谱


        ·2878  ·  China Pharmacy 2019 Vol. 30 No. 20                                中国药房    2019年第30卷第20期
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