Page 26 - 《中国药房》2026年10期
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新培养瓶中冻存。细胞冻存时使用无血清冻存液，复苏 RNA，反转录为 cDNA，再进行 PCR 扩增。PCR 反应体
时需快速置于37 ℃水浴锅融化，离心去除冻存液，然后 系包括 SYBR Green qPCR Premix 10 μL，正、反向引物
混匀接种于培养瓶中。 各 0.4 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 7.2 μL。扩增程序如下：
2.2 异绿原酸A对HepG2细胞增殖的影响 95 ℃预变性30 s；95 ℃变性10 s，60 ℃退火延伸30 s，共
取对数生长期的 HepG2 细胞，按 4×10 个/孔接种 40个循环。以β-肌动蛋白（β-actin）为内参，采用2 －ΔΔCt 法
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于96孔板中，过夜培养后弃原培养基，加入含不同质量 计 算 含 DEP 结 构 域 的 mTOR 相 互 作 用 蛋 白（DEP
浓度（0.1、0.125、0.2、0.25、0.4、0.5 mg/mL，浓度设置参考 domain-containing mTOR-interacting protein，DEPTOR）
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相关文献 ）异绿原酸A的培养基作为实验组，另设空白 mRNA 的表达量，结果以对照组为参照进行归一化处
组（不加药物和细胞，只加培养基）和对照组（不加药物， 理。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司设计、合
加细胞和培养基），每组设 3 个复孔。分别培养 24、36、 成。DEPTOR正向序列为5′-ACTGGCTGGTTCAGGA-
48 h后，每孔加入100 μL的CCK-8工作液，继续孵育30 AGGTGA-3′，反向序列为5′-GCTGTCCACAAATGGG-
min，用酶标仪测定其在450 nm波长处的光密度（optical TGCTTG-3′，片段大小为119 bp；β-actin正向序列为5′-
density，OD）值，按下式计算细胞存活率：细胞存活率 TGACGTGGACATCCGCAAAG-3′，反向序列为 5′-CT-
（%）＝（实验组OD值－空白组OD值）/（对照组OD值－ GGAAGGTGGACAGCGAGG-3′，片段大小为205 bp。
空白组OD值）×100%。使用GraphPad Prism 9.4.1软件 2.6 异绿原酸 A 对 HepG2 细胞中 PI3K/Akt/mTOR 信
分析半数抑制浓度（half-maximal inhibitory concentra‐ 号通路相关蛋白表达的影响
tion，IC50 ）。 取对数生长期的 HepG2 细胞，接种于 6 孔板中，过
2.3 异绿原酸A对HepG2细胞侵袭能力的影响 夜贴壁后，按“2.3”项下方法分组、加药、干预后，弃培养
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取对数生长期的 HepG2 细胞，按 5×10 个/孔接种 基，用 PBS 洗 2 次，每孔加入 200 μL 高效 RIPA 裂解液，
于6孔板中，过夜贴壁后，分别加入0（对照组）、0.25、0.5 置于冰上充分裂解后，于 4 ℃下以 14 000 r/min 离心
mg/mL（根据“2.2”项下实验结果设置，作为异绿原酸 A 5min，取上清液转移至1.5 mL离心管中，采用BCA法测
低、高浓度组，下同）的异绿原酸 A 干预 48 h，每个浓度 定蛋白浓度，煮沸变性 10 min，置于－80 ℃冰箱保存备
设3个复孔。提前用Matrigel基质胶包被Transwell小室 用。取变性蛋白样本上样，经电泳分离后转膜，加入快
上室，于37 ℃条件下聚合1 h；随后将6孔板细胞消化并 速 封 闭 液 室 温 封 闭 30 min，加 入 p-Akt、Akt、mTOR、
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调整密度为 2×10 个/mL，取 100 μL 细胞悬液加入上 PI3K、PTEN、GAPDH 抗体（稀释比例均为 1∶1 000、1∶
室，下室加入 600 μL 含 20% 胎牛血清的培养基，置于 1 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶10 000），于4 ℃下孵
CO2培养箱中常规培养48 h。取出Transwell小室，用4% 育过夜；次日洗涤后加入二抗（稀释比例为1∶5 000），室
多聚甲醛固定 25 min、0.1% 结晶紫染色 20 min 后，使用 温孵育 1 h，洗涤后滴加 ECL 发光液进行显影。使用
倒置显微镜进行观察，每组随机选取5个视野进行细胞 Image J 软件分析条带灰度值，以目的蛋白与内参蛋白
计数，按下式计算细胞侵袭率：细胞侵袭率（%）＝实验 （GAPDH）的灰度值比值表示目的蛋白的表达量，以
组侵袭细胞数/对照组侵袭细胞数×100%。 p-Akt与Akt的灰度值比值表示Akt蛋白磷酸化水平。
2.4 异绿原酸A对HepG2细胞迁移能力的影响 2.7 异绿原酸A干预HepG2细胞的生物信息学分析
取对数生长期的 HepG2 细胞，接种于 6 孔板中，贴 HepG2 细胞常规传代培养，按“2.3”项下方法分组、
壁长满后，用无菌 200 μL 枪头垂直划 3 条平行线，以 加药、干预后，弃培养基，用预冷的PBS洗涤细胞2次，加
PBS洗涤去除脱落细胞，按“2.3”项下方法分组、加药，分 入 0.25% 胰蛋白酶消化 2 min，随后离心 5 min，弃上清
别于干预0（划痕初始）、24、48 h时使用倒置显微镜进行 液，将细胞沉淀经液氮速冻后转移至－80 ℃冰箱保存，
观察并拍照，用Image J软件测量划痕面积，并按下式计 后续用干冰运输至北京诺禾致源科技股份有限公司进
算细胞迁移率：细胞迁移率（%）＝（划痕初始面积－培 行检测。采用液相色谱-串联质谱法进行代谢组学检
养后划痕面积）/划痕初始面积×100%。 测，分析细胞内代谢物谱，重点筛选并分析与氨基酸、核
2.5 异绿原酸 A 对 HepG2 细胞中 DEPTOR mRNA 表 苷酸、糖及脂质代谢相关的差异代谢物。通过偏最小二
达的影响 乘判别分析进行分组判别、筛选差异代谢物，并结合京
取对数生长期的 HepG2 细胞，接种于 6 孔板中，过 都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes
夜贴壁后，按“2.3”项下方法分组、加药、干预后，弃培养 and Genomes，KEGG）通路富集分析，明确差异代谢物及
基，用 PBS 洗 2 次，用 RNA 快速提取试剂盒提取总 其富集的信号通路。采用RNA测序技术进行转录组学
· 1260 · China Pharmacy 2026 Vol. 37 No. 10 中国药房 2026年第37卷第10期
