Page 74 - 《中国药房》2025年23期
P. 74

2.3 分组与给药                                           AMPK、AMPK、p-Drp1、Drp1、GAPDH 抗体（稀释比例
              将 成 功 造 模 的 大 鼠 随 机 分 为 CIRI 组 、低 剂 量           分别为 1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶
          BYHWD（L-BYHWD）组、高剂量BYHWD（H-BYHWD）                   1 000、1∶1 000、1∶5 000），于4 ℃下孵育过夜；次日，加入
          组、阳性对照组、H-BYHWD+溶剂对照组、H-BYHWD+                      相应二抗（稀释比例为1∶5 000），于室温孵育2 h；以ECL
          Compound C 组，每组 15 只。后 5 组大鼠于再灌注 24 h               显影后，用Image J软件分析蛋白条带灰度值，以目的蛋
          后开始干预：L-BYHWD组、H-BYHWD组大鼠分别灌胃                       白与内参蛋白（GAPDH）的灰度值比值评价目的蛋白的
                                                 [7]
          3.15、12.60 mg/kg（以提取物质量计）BYHWD ，阳性对                 表达水平，以 p-AMPK 与 AMPK、p-Drp1 与 Drp1 的灰度
                                                     [10]
          照组大鼠灌胃 ip 150 mg/kg 银杏叶提取物注射液 ，H-                   值比值评价AMPK、Drp1的磷酸化水平。
          BYHWD+溶剂对照组大鼠灌胃12.60 mg/kg BYHWD和                   2.9 统计学方法
          ip  20  mg/kg 二 甲 基 亚 砜（DMSO），H-BYHWD+Com‐              数据用SPSS 25.0软件进行统计分析。计量资料均
          pound C组大鼠灌胃12.60 mg/kg BYHWD和ip 20 mg/kg           符合正态分布，以 x±s 表示，多组间比较采用单因素方
          Compound C（先用DMSO溶解，临用前用生理盐水稀释                      差分析，进一步两两比较采用Dunnett-t检验。检验水准
                     [11]
          至2 mg/mL） 。假手术组和CIRI组大鼠灌胃和ip等量                      α＝0.05。
          生理盐水（灌胃以H-BYHWD体积为准，ip以Compound                     3 结果
          C体积为准）。为了保证操作步骤的一致性，L-BYHWD                         3.1 BYHWD对脑梗死体积的影响
          组、H-BYHWD 组、阳性对照组大鼠先 ip 后再灌胃等量                          与假手术组（未见明显梗死，计为0）比较，CIRI组大
          生理盐水。各组大鼠每日干预1次，连续4周。                               鼠的脑梗死体积百分比[（37.59±4.12）%]显著升高（P＜
          2.4 脑梗死体积检测                                         0.05）；与 CIRI 组比较，L-BYHWD 组、H-BYHWD 组、阳
              末次给药后，各组随机取5只大鼠，麻醉后断头取全                         性对照组大鼠的脑梗死体积百分比[分别为（25.31±
          脑，制成 2 mm 冠状切片，用 2%TTC 染液在室温下避光                     2.76）% 、（8.16±2.51）% 、（7.73±2.47）% ] 均 显 著 降 低
          染色 30 min，再用 4% 多聚甲醛固定 24 h。通过 Image J             （P＜0.05）；与 H-BYHWD 组、H-BYHWD+溶剂对照组
          软件扫描切片并计算脑梗死体积百分比。                                  [ （8.17±2.53）%]比较，H-BYHWD+Compound C 组大鼠
          2.5 缺血性半暗带区内皮细胞线粒体超微结构观察                            的脑梗死体积百分比[（32.50±3.58）%]显著升高（P＜
              各组另取5只大鼠，麻醉后快速取脑，切取缺血性半                         0.05）；与H-BYHWD组比较，H-BYHWD+溶剂对照组大
          暗带（ischemic penumbra，IP）区1 mm 组织块，在2.5%戊            鼠脑梗死体积百分比差异无统计学意义（P＞0.05）。
                                         3
          二醛中固定24 h、1%四氧化锇中固定2 h，梯度脱水后在                       3.2 BYHWD对IP区内皮细胞线粒体超微结构的影响
          618环氧树脂中包埋，制成60～90 nm切片，再用醋酸铀                           假手术组大鼠IP区内皮细胞线粒体形态正常，双层
          酰在室温下染色30 min、柠檬酸铅在室温下染色15 min。                     膜结构清晰且多呈杆状，嵴较多；与假手术组比较，CIRI
          使用透射电镜观察IP区内皮细胞线粒体超微结构。                             组大鼠 IP 区内皮细胞线粒体出现明显病变——普遍肿
          2.6 IP区线粒体膜电位评估                                     胀且多呈球状，嵴发生断裂，伴空泡现象严重；与CIRI组
              取“2.5”项下剩余的IP区脑组织，加入预冷的磷酸盐                      比较，L-BYHWD 组、H-BYHWD 组、阳性对照组大鼠 IP
          缓冲液制成匀浆，用200目尼龙网过滤，于4 ℃下以3 000                      区内皮细胞线粒体病变有不同程度改善；与H-BYHWD
          r/min 离心 10 min，取沉淀，用 JC-1 工作液重悬，于 37 ℃             组 、H-BYHWD+ 溶 剂 对 照 组 比 较 ，H-BYHWD+Com‐
          下避光孵育20 min后再用磷酸盐缓冲液洗涤，用流式细                         pound C 组大鼠 IP 区内皮细胞线粒体病变加重；与 H-
          胞仪分析荧光信号，以绿色荧光单阳性细胞（去极化细                            BYHWD 组比较，H-BYHWD+溶剂对照组大鼠 IP 区内
          胞）占总细胞的比例（记为H1-LR）来评估线粒体膜电位。                        皮细胞线粒体超微结构无明显差异。结果见图1。
          H1-LR数值越大，表示膜电位越低。                                  3.3 BYHWD对IP区线粒体膜电位的影响
          2.7 IP区OPA1与CD31荧光共定位面积比检测                              与假手术组比较，CIRI组大鼠IP区线粒体膜电位显
              取各组剩余 5 只大鼠的部分 IP 区脑组织，用 4% 多                   著降低（P＜0.05）；与 CIRI 组比较，L-BYHWD 组、H-
          聚甲醛固定 24 h，经梯度脱水、包埋后冷冻，制成 5 μm                      BYHWD组、阳性对照组大鼠IP区线粒体膜电位均显著
          厚的冠状切片，经洗涤、封闭后，加入OPA1、CD31抗体，                       升高（P＜0.05）；与 H-BYHWD 组、H-BYHWD+溶剂对
          于4 ℃下孵育18 h；次日，加入相应二抗，于25 ℃下孵育                      照组比较，H-BYHWD+Compound C组大鼠IP区线粒体
          2 h，洗涤、封片。使用荧光倒置显微镜进行观察，同时使                         膜电位显著降低（P＜0.05）；与 H-BYHWD 组比较，H-
          用Image J软件分析OPA1与CD31荧光共定位面积比。                      BYHWD+溶剂对照组大鼠IP区线粒体膜电位差异无统
          2.8 IP 区 MFN2、OPA1、Fis1 蛋白及 AMPK/Drp1 通路            计学意义（P＞0.05）。结果见图2和表1。
          相关蛋白表达检测                                            3.4 BYHWD 对 IP 区 OPA1 与 CD31 荧光共定位面积
              取“2.7”项下剩余的 IP 区脑组织，加入 RIPA 裂解液                 比的影响
          制成匀浆，提取总蛋白，测定蛋白浓度；加热变性后，上                               与假手术组比较，CIRI 组大鼠 IP 区 OPA1 与 CD31
          样进行电泳、转膜、封闭，加入 MFN2、OPA1、Fis1、p-                    荧光共定位面积比显著降低（P＜0.05）；与CIRI组比较，


          · 2948 ·    China Pharmacy  2025 Vol. 36  No. 23                            中国药房  2025年第36卷第23期
   69   70   71   72   73   74   75   76   77   78   79