Page 37 - 《中国药房》2025年17期
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在450 nm处的光密度（即OD450值），OD450值越大说明细                  GCC-3′，扩增产物大小为 218 bp；PCNA 的正向引物序
          胞增殖活性越强。                                           列为 5′-AAGGCTTCGACACATACCGC-3′，反向引物
          2.1.4 TE1细胞凋亡检测                                    序列为 5′-AGCTGTACTCCTGTTCTGGGA-3′，扩增产
              采用流式细胞术检测。取 TE1 细胞按“2.1.2”项下                   物大小为 181 bp；Bim 的正向引物序列为 5′-TGTTCA-
          方法分组、给药后，用不含EDTA的胰酶消化2 min，加入                      TCACCACACAGCAG-3′，反向引物序列为 5′-GCAG-
          含血清培养基终止消化，以1 000 r/min 离心 5 min，收集                GATTTTGTGTAAGAAT-3′，扩增产物大小为 160 bp；
          细胞。将收集的 TE1 细胞（5×10 个）用磷酸盐缓冲液                      MIEN1 的正向引物序列为 5′-CTGTCATTCCACTCCT-
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         （PBS）洗涤2次后重悬于500 μL结合缓冲液中，向细胞                       CTAG-3′，反向引物序列为 5′-GCGTCATCCTGTGAC-
          悬液中加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC和5 μL碘化丙啶（PI）              TGCAC-3′，扩增产物大小为 162 bp；MMP-9 的正向引
          并避光孵育15 min，然后上机检测细胞凋亡情况。                          物序列为 5′-GCCGGGAACGTATCTGGAAA-3′，反向
          2.1.5 TE1细胞侵袭检测                                    引物序列为 5′-GGTTGTGGAAACTCACACGC-3′，扩
              采用 Transwell 小室法检测。取 TE1 细胞按“2.1.2”            增产物大小为 165 bp。上述引物均由广州基迪奥生物
          项下方法分组、给药后，将200 μL不含胎牛血清的细胞                        科技有限公司设计并合成。以 GAPDH 为内参，采用
          悬液（5×10 个/mL）置于基质胶包被的Transwell小室的                  2 －ΔΔCt 法计算各目的基因的相对表达量。
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          上室中，向小室的下室加入 500 μL 含胎牛血清的培养                       2.1.8 TE1细胞中HIF-1α、IL-8蛋白表达检测
          基，在 37 ℃、5%CO2培养箱中孵育 24 h 后，用棉签轻轻                      采用 Western blot 法检测。取 TE1 细胞按“2.1.2”项
          擦去上室中未侵袭的细胞，用 PBS 漂洗 3 次。以 4% 多                    下方法分组、给药后，采用RIPA缓冲液提取各组细胞中
          聚甲醛固定 30 min，以 0.1% 结晶紫染色 20 min。采用                的总蛋白，通过 BCA 法对总蛋白进行定量。将蛋白进
          Image J软件计数侵袭的细胞数。                                 行高温变性后，取 45 μg 上样进行 10% SDS-PAGE 分离
          2.1.6 TE1细胞迁移检测                                   （电压 100 V，时间 1 h），然后转移（电流 300 mA，时间 2
              采用划痕实验法检测。取 TE1 细胞按“2.1.2”项下                   h）到 PVDF 膜上，以 5% 脱脂牛奶阻断膜 1 h；加入 HIF-
          方法分组、给药后，分别将各组TE1细胞接种于6孔板中                         1α（稀释比例1∶3 000）、GAPDH（稀释比例1∶4 000）、IL-
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         （1×10 个/孔），连续孵育至单层细胞均匀分布于板底。                        8（稀释比例 1∶2 000）一抗，在 4 °C 下孵育 24 h；加入二
          用移液器尖端在细胞表面制造划痕。用 PBS 冲洗细胞                         抗（稀释比例 1∶4 000），在室温下孵育 1.5 h。利用增强
          数次以去除所有漂浮细胞，并用不含胎牛血清的培养基                           的化学发光试剂显影以可视化免疫反应条带，采用化学
          孵育细胞，分别于 0、24 h 时观察划痕。使用 Image J 软                 发光成像仪捕获蛋白质信号，采用 Image J 软件测量和
          件分析划痕宽度，并计算划痕愈合率[划痕愈合率（%）＝                         分 析 蛋 白 条 带 灰 度 值 ，以 目 的 蛋 白 与 内 参 蛋 白
         （0 h 时划痕宽度－24 h 时划痕宽度）/0 h 时划痕宽度×                  （GAPDH）条带灰度值比值表示目的蛋白的表达水平。
          100%]。                                             2.2 荷瘤小鼠实验
          2.1.7 TE1 细胞中增殖、凋亡、迁移和侵袭相关基因                           将TE1细胞悬液通过皮下注射接种到BALB/c裸鼠
                                                                                6
          mRNA表达检测                                           右外侧腋窝区（5×10 个/只），每日观察肿瘤生长情况。
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              采用荧光定量 PCR 法检测细胞中增殖细胞核抗原                       当瘤体体积长至约 100 mm 时，表明裸鼠移植瘤模型构
                                                                   [10]
         （proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、Bcl-2 相互作  建成功 。本研究共30只裸鼠建模成功。将这30只裸
          用 的 细 胞 死 亡 介 质（Bcl-2  interacting  mediator  of  cell   鼠随机分为空白组，二甲双胍低、中、高剂量组，IDF-
          death，Bim）、迁移侵袭增强因子 1（migration and inva‐          11774组和二甲双胍高剂量+DMOG组，每组5只。二甲
          sion enhancer 1，MIEN1）、基质金属蛋白酶 9（matrix me‐        双胍低、中、高剂量组裸鼠分别灌胃62.5、125、250 mg/kg
                                                                                                 [10]
          talloproteinase-9，MMP-9） mRNA 表达。取 TE1 细胞按         二甲双胍，并腹腔注射等体积的生理盐水 ；IDF-11774
         “2.1.2”项下方法分组、给药后，采用 TRIzol 试剂分别提                   组裸鼠灌胃 50 mg/kg IDF-11774，并腹腔注射等体积的
                                                                     [11]
          取各组细胞中总 RNA，进行浓度和纯度检测后，取 1 μg                      生理盐水 ；二甲双胍高剂量+DMOG 组裸鼠灌胃 250
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          RNA 逆转录合成 cDNA，并以 cDNA 为模板进行荧光定                    mg/kg 二甲双胍，并腹腔注射 250 mg/kg DMOG ；空白
          量 PCR 反应。PCR 反应条件为：95 ℃预变性 10 min；                 组裸鼠灌胃并腹腔注射等体积的生理盐水，每天1次，持
          95 ℃变性 10 s，62 ℃退火 1 min，72 ℃延伸 20 s，共循环           续4周。4周后处死裸鼠，收集移植瘤瘤体，称定瘤体质
          40次。PCR反应体系为：cDNA模板2 μL，正、反向引物                     量，采用游标卡尺测量瘤体的长径（L）和短径（W），按公
                                                                                             2
          各 1  μL，SYBR  Green  Mix  10  μL，去 离 子 水 6  μL。    式计算肿瘤体积：肿瘤体积＝L×W /2。采用 Western
          GAPDH 的正向引物序列为 5′-TCATTTCCTGGTATG-                 blot法检测肿瘤组织中HIF-1α、IL-8蛋白的表达（具体操
          ACA-3′，反向引物序列为 5′-GTCTTACTCCTTGGAG-                作同“2.1.8”项下）。


          中国药房  2025年第36卷第17期                                              China Pharmacy  2025 Vol. 36  No. 17    · 2115 ·
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