Page 66 - 《中国药房》2025年6期
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2.3 miR-154-5p/CCND1 轴与 LncRNA MALAT1 靶向            白与GAPDH条带灰度值的比值表示目标蛋白的相对表
          关系的验证                                               达量。
          2.3.1 细胞分组与转染                                       2.3.7 LncRNA MALAT1、miR-154-5p、CCND1 相互作
              将 10% 胎牛血清加入含 0.1 μmol DOX（根据“2.1”              用检测
          项下结果确定）的 DMEM 培养基，培养 MG-63/DOX 细                        采用双荧光素酶报告基因实验检测。将 LncRNA
          胞，每 2～3 d 进行换液。取对数生长期的 MG-63/DOX                    MALAT1-野生型（wild type，WT）和 LncRNA MALAT1-
          细胞分为 Control 组（正常培养）、sh-NC 组、sh-MALAT1              突变型（mutated type，MUT）、CCND1-MUT 和 CCND1-
          组、sh-MALAT1+anti-NC 组、sh-MALAT1+anti-miR-154-       WT 片段分别克隆到 pmirGLO 载体中，再与 miR-154-5p
          5p组，分别转染相应质粒。                                       模拟物（mimic）和其阴性对照（mimic-NC）共转染到
          2.3.2 LncRNA MALAT1、miR-154-5p、CCND1 mRNA           MG-63/DOX细胞中，48 h后检测荧光素酶活性，以分析
          检测                                                  LncRNA MALAT1与miR-154-5p、miR-154-5p与CCND1
              采用“2.2”项下方法检测各组 MG-63/DOX 细胞中                   之间的相互作用。
          LncRNA  MALAT1、miR-154-5p（ 内 参 U6）、CCND1            2.4 统计学分析
          mRNA（内参GAPDH）的相对表达量，以验证转染效率。                            采用SPSS 25.0软件进行数据分析。满足正态分布
          2.3.3 MG-63/DOX细胞增殖检测                               的计量资料以 x±s 表示，多组间比较采用方差分析，进
              采用 CCK-8 法检测。根据“2.3.1”项下方法将 MG-                 一步两两比较使用 LSD-t 检验；两组间比较采用独立样
          63/DOX 细胞进行分组，再按“2.1”项下操作检测各组细                      本t检验。检验水准α＝0.05。
          胞的增殖情况，并计算细胞存活率。                                    3 结果
          2.3.4 MG-63/DOX细胞迁移和侵袭检测                            3.1 不同浓度 DOX 中 MG-63 和 MG-63/DOX 细胞存
             （1）采用划痕实验检测。根据“2.3.1”项下方法进行                      活率比较
          分组，接种 500 个 MG-63/DOX 细胞于 6 孔板至 80%～                    与 0 μmol/L DOX 组比较，0.01、0.05、0.1、1 μmol/L
          90% 融合时，用 10 μL 移液器枪头取细胞悬浮液在培养                      DOX 组 MG-63 细胞和 MG-63/DOX 细胞（0.01 μmol/L
          皿中间划痕，于 0、24 h 在显微镜下观察细胞的形态变                        DOX 组除外）存活率均显著降低（P＜0.05），详见表 2。
          化，并计算划痕愈合率。划痕愈合率（%）＝（初始划痕                           经计算，DOX 对 MG-63 细胞的 IC50 为 0.07 μmol/L，对
          宽度－细胞迁移距离）/初始划痕宽度×100%。                             MG-63/DOX细胞的IC50为0.13 μmol/L。
             （2）采用Transwell实验检测。根据“2.3.1”项下方法                 表2 不同浓度 DOX 中 MG-63 和 MG-63/DOX 细胞存
          将 MG-63/DOX 细胞进行分组。在侵袭实验上室预涂                             活率比较（x±s，n＝6,%%）
          Matrigel 基质胶，收集转染的 MG-63/DOX 细胞，将细胞                 DOX浓度/（μmol/L）     MG-63细胞         MG-63/DOX细胞
                                              4
          重悬于 200 μL 无血清培养基中，以 2×10 个/孔加入上                    0                   100               100
                                                              0.01              84.52±9.08 a      91.85±9.49
          室，下室加入500 μL含20%胎牛血清的培养基，孵育36
                                                              0.05              63.59±8.16 a      76.54±8.27 a
          h 后，固定上室膜并染色，在显微镜下随机选择 5 个视                         0.1               39.28±7.43 a      53.85±7.32 a
          野，统计迁移或侵袭细胞数。                                       1                 21.32±6.27 a      32.59±6.34 a
          2.3.5 MG-63/DOX细胞凋亡检测                                  a：与0 μmol/L组比较，P＜0.05。
              采用流式细胞仪检测。根据“2.3.1”项下方法将                        3.2  MG-63 和 MG-63/DOX 细 胞 LncRNA  MALAT1
          MG-63/DOX 细胞进行分组。收集细胞，重悬调整密度                        mRNA表达检测结果
                   6
          为1.0×10 个/mL，加入100 μL含有Annexin Ⅴ-FITC/PI                MG-63/DOX细胞中LncRNA MALAT1 mRNA相对
          的溶液中，室温孵育 20 min 后，加入 500 μL 孵育缓冲                   表达量显著高于MG-63细胞（2.36±0.35 vs.1.00±0.32，
          液，检测细胞凋亡情况，计算细胞凋亡率。细胞凋亡                             P＜0.05）。
          率＝（凋亡细胞数/总细胞数）×100%。                                3.3 敲低 LncRNA MALAT1 对 MG-63/DOX 细胞中
          2.3.6 MG-63/DOX细胞中PCNA、CCND1蛋白表达检测                  DOX耐药相关mRNA表达的影响
              采用 Western blot 法检测。根据“2.3.1”项下方法将                  sh-MALAT1 组 MG-63/DOX 细 胞 中 LncRNA
          MG-63/DOX 细胞进行分组。采用改良的 RIPA 裂解液                     MALAT1、CCND1 mRNA 相对表达量显著低于 Control
          和苯甲基磺酰氟裂解细胞，提取蛋白质，采用BCA法检                           组、sh-NC 组，miR-154-5p 相对表达量显著高于 Control
          测蛋白浓度，再用 10% 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝                         组、sh-NC组（P＜0.05）；sh-MALAT1+anti-miR-154-5p组
          胶电泳分离，转移到聚偏氟乙烯膜上与 GAPDH（稀释                          MG-63/DOX 细胞中 CCND1 mRNA 相对表达量显著高
          度 1∶1 000）、PCNA（稀释度 1∶5 000）、CCND1（稀释度              于 sh-MALAT1 组、sh-MALAT1+anti-NC 组，miR-154-5p
          1∶500）特异性抗体共同孵育，再加入二抗（稀释度 1∶                        相对表达量显著低于 sh-MALAT1 组、sh-MALAT1+anti-
          1 000），室温孵育1 h。采用Image J 软件分析，以目标蛋                  NC组（P＜0.05）。结果见表3。


          · 700 ·    China Pharmacy  2025 Vol. 36  No. 6                               中国药房  2025年第36卷第6期
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