Page 23 - 《中国药房》2025年6期
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2.3 大鼠动情周期变化观察 苯透明后，以中性树胶封片，使用显微镜观察并采集图
自造模第1天起，每组随机选取3只大鼠进行标记， 像。采用 Image-Pro Plus 6.0 软件对上述蛋白阳性表达
于每天上午9点进行阴道脱落细胞涂片检查，观察大鼠 区域（呈黄褐色或棕黄色）进行光密度分析，用以反映其
在整个造模期间的动情周期变化：抓取大鼠，暴露阴道， 表达水平。
轻柔地将经生理盐水浸润的无菌棉签插入其阴道，旋转 2.8 大鼠骨组织中 VDR、CYP27B1、CYP24A1、MPO、
2～3圈以刮取阴道分泌物；将分泌物均匀涂抹在载玻片 NE蛋白表达检测
上，用0.1%亚甲基蓝染色液染色，随后使用显微镜观察 采用Western blot法检测。取“2.4”项下冻存的各组
并拍照。根据观察到的细胞类型和数量，判断大鼠所处 大鼠（每组随机选取3只）股骨组织样本，研磨，置于含有
的动情阶段——若存在有核上皮细胞且偶见无核角化 组织蛋白裂解液、蛋白酶抑制剂的 1.5 mL 微量离心管
细胞，记为动情前期；若主要为无核角化细胞，记为动情 中，匀浆，在冰上裂解 30 min，再以 14 000 r/min 离心 15
期；若同时可见白细胞、无核角化细胞、有核上皮细胞， min，收集上清液，并使用 BCA 法测定蛋白浓度。向蛋
记为动情后期；若为大量白细胞伴少量角化细胞，记为 白样品中加入5×loading buffer适量，在95 ℃下加热15
[13]
动情间期 。如果大鼠在整个观察期内持续处于某一 min 使蛋白变性。取适量变性蛋白，进行十二烷基硫酸
时期，则判断其动情周期出现了紊乱，提示 POF 模型建 钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离后转膜，用
立成功。 5%牛血清白蛋白溶液封闭1 h；弃去封闭液，加入VDR、
2.4 标本采集与处理 CYP27B1、CYP24A1、MPO、NE、β-actin 一抗（稀释比例
末次给药后，所有大鼠禁食、不禁水24 h，腹腔注射 分别为 1∶5 000、1∶2 000、1∶1 000、1∶5 000、1∶2 000、1∶
3%戊巴比妥钠（30 mg/kg）进行麻醉，从腹主动脉采集血 5 000），在 4 ℃下孵育过夜；以 TBST 缓冲液洗膜后，加
样，静置 2 h 后以 3 000 r/min 离心 15 min，得到上层血 入相应二抗[稀释比例分别为1∶2 000（羊抗兔）、1∶5 000
清，分装后于－80 ℃下保存，备用。采血后，以颈椎脱臼 （羊抗鼠）]，在室温下孵育 1 h；以 TBST 缓冲液洗膜后，
法将大鼠处死，迅速收集其两侧股骨并剥离软组织。将 使用化学发光试剂进行显影，并置于化学发光凝胶成像
左侧股骨组织放入 4% 多聚甲醛溶液中固定保存，右侧 仪下成像。使用 Image J 软件分析蛋白条带的灰度值，
股骨组织则于－80 ℃下保存，备用。 以目的蛋白与内参蛋白（β-actin）的灰度值比值作为目的
2.5 大鼠血清 E2、NETs、25（OH）D3、RANKL、BGP 水 蛋白的表达水平，结果以正常组为参照进行归一化
平检测 处理。
取“2.4”项下冻存的各组大鼠（每组随机选取 6 只） 2.9 统计学方法
的血清样品，严格按照相应试剂盒说明书操作，采用 采用 GraphPad Prism 8.0.2 软件对数据进行统计分
ELISA 法以酶标仪检测其血清 E2、NETs、25（OH）D3、 析。对于符合正态分布的数据，采用 x±s 表示，多组间
RANKL、BGP水平。 比较采用单因素方差分析（方差齐）或 Welch 方差分析
2.6 大鼠骨组织病理变化观察 （方差不齐），进一步两两比较采用Tukey’s事后检验（方
取“2.4”项下经 4% 多聚甲醛溶液固定的各组大鼠 差齐）或Tamhane’s T2事后检验（方差不齐）。检验水准
（每组随机选取3只）股骨组织样本，放入15%乙二胺四 α＝0.05。
乙酸脱钙液中行脱钙处理；确保骨质软化后，进行梯度 3 结果
乙醇脱水、常规石蜡包埋后切片；取切片，依次进行苏木 3.1 大鼠动情周期变化
精、伊红染色，再经梯度乙醇脱水、二甲苯透明后，以中 正常组大鼠动情前期、动情期、动情后期、动情间期
性树胶封片，使用显微镜观察其骨组织病理变化。 循环可见，动情周期正常（图1）。与正常组比较，其余各
2.7 大鼠骨组织中VDR、MPO、NE、CitH33蛋白阳性表 组大鼠动情周期紊乱，多数处于动情前期，甚至未见完
达检测 整的动情周期，表明大鼠卵巢受损，其功能受到抑制，提
采用免疫组化法检测。取“2.6”项下各组大鼠的骨 示POF模型复制成功。
组织切片，经梯度乙醇脱水后，滴加0.01 mmol/L Tris-乙 3.2 当归补血汤对模型大鼠血清E2、NETs、25（OH）D33、
二胺四乙酸修复液（pH9.0），孵育15 min；以磷酸盐缓冲 RANKL、BGP水平的影响
液（PBS）漂洗后，滴加 3% 过氧化氢以阻断内源性过氧 与正常组相比，模型组大鼠血清 NETs、RANKL 水
化物酶，于室温下静置15 min；以PBS再次漂洗后，加入 平均显著升高，而 E2、25（OH）D3、BGP 水平均显著降低
山羊血清于 37 ℃下孵育 30 min；滴加 VDR、MPO、NE、 （P＜0.05）。与模型组相比，骨化三醇组、当归补血汤各
CitH3 一抗（稀释比例均为 1∶100），在 4 ℃下孵育过夜； 剂量组大鼠血清 NETs 水平以及骨化三醇组、当归补血
以 PBS 漂洗后，滴加适量二抗（即免疫组化显色试剂中 汤高剂量组大鼠血清 RANKL 水平均显著降低，骨化三
的 A 液），室温孵育 30 min；以 PBS 漂洗后，滴加 DAB 显 醇组、当归补血汤各剂量组大鼠血清 E2、25（OH）D3、
色液显色，再以苏木精复染10 s，用梯度乙醇脱水、二甲 BGP水平均显著升高（P＜0.05）。结果见表1。
中国药房 2025年第36卷第6期 China Pharmacy 2025 Vol. 36 No. 6 · 657 ·
