Page 64 - 《中国药房》2025年4期
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R20479）购自上海源叶生物科技有限公司；DMEM培养                        g/（kg·d）灌胃相应药液，阴性对照组大鼠灌胃等体积生
          基（批号 8123233）购自赛默飞世尔科技（中国）有限公                       理盐水，每天灌胃 2 次，连续给药 5 d。按照相关文

          司；聚偏二氟乙烯膜（批号IPVH00010）购自密里博中国                       献 [10―12] 折算出大鼠的顺铂使用剂量进行预实验，根据预
          有限公司；Annexin Ⅴ-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒（批                   实验结果设置阳性对照组大鼠的给药剂量，即阳性对照
          号 556547）购自美国 BD 公司；磷酸酶抑制剂、二辛可酸                     组大鼠按 4.2 mg/kg 腹腔注射顺铂注射液，隔日 1 次，即
          法蛋白含量检测试剂盒、RIPA 裂解液（批号分别为                           第 1、3、5 天给药。末次给药后 1～2 h，腹腔注射三溴乙
          P1045、P0011、P0013）均购自上海碧云天生物技术有限                    醇麻醉各组大鼠，经腹主动脉取血，分离血清；合并同组
          公司；ECL 显色液（批号 FP302）购自安迪福诺生物科技                      血清，灭活，滤过，除菌，制得散剂血清、汤剂血清、阳性
         （武汉）有限公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠、                            对照血清和阴性对照血清，均于－20 ℃冻存备用。
          山 羊 抗 兔 免 疫 球 蛋 白 G（IgG）二 抗（批 号 分 别 为               2.3 细胞分组与干预

          BA1050、BA1054）均购自武汉博士德生物工程有限公                       2.3.1 三虫通络散结方含药血清的最佳干预浓度筛选
                                                                  取对数生长期的Lewis肺癌细胞，以胰酶消化，将细
          司；兔源甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体（批号
                                                                               5
                                                              胞浓度调整至1×10 个/mL，以每孔100 μL细胞悬液接
          BF0198）购自江苏亲科生物研究中心有限公司；兔源血
                                                              种于 96 孔板。细胞分为 8 组，分别为阴性对照血清组、
          管 内 皮 生 长 因 子（vascular  endothelial  growth  factor，
                                                              阳性对照血清组、5%散剂血清组、10%散剂血清组、20%
          VEGF）、缺氧诱导因子 1α（hypoxia-inducible factor-1α，
                                                              散剂血清组、5% 汤剂血清组、10% 汤剂血清组、20% 汤
          HIF-1α）、脯氨酰羟化酶2（prolyl hydroxylase-2，PHD2）、
                                                              剂血清组，每组设 3 个复孔。各组分别给予“2.2”项下
          基质金属蛋白酶 2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）
                                                              10%阴性对照血清、10%阳性对照血清和相应浓度含药
          抗 体（批 号 分 别 为 ab214424、ab179483、ab226890、
                                                              血清干预，于干预前及干预 24、48、72 h 后，每孔加入
          ab181286）均购自艾博抗（上海）贸易有限公司；兔源
                                                              10%CCK-8 溶液100 μL，于 37 ℃、5%CO2细胞培养箱内
          ERK、JNK、p38 MAPK 抗体（批号分别为#4695、#9252、
                                                              孵育2 h，用酶标仪检测450 nm波长处的吸光度，计算增
          #8690）均购自赛信通（上海）生物试剂有限公司。
                                                              殖抑制率：增殖抑制率＝（1－药物组吸光度/阴性对照血
          1.3 实验动物和细胞
                                                              清组吸光度）×100%。根据增殖抑制率筛选三虫通络
              雄性 SD 大鼠 44 只，清洁级，体重（200±20）g，购自
                                                              散结方含药血清的最佳干预浓度。
          广东省医学实验动物中心，实验动物生产许可证号为
                                                              2.3.2 药物干预
          SCXK（粤）2022-0002。所有大鼠均饲养于广东至远生
                                                                  取对数生长期的Lewis肺癌细胞，以胰酶消化，将细
          物医药科技有限公司，饲养室温度 25 ℃、相对湿度
                                                                               5
                                                              胞浓度调整至1×10 个/mL，以每孔100 μL细胞悬液接
          40%，大鼠自由摄食及饮水。小鼠Lewis肺癌细胞株（批
                                                              种于 96 孔板。根据“3.1”项下含药血清浓度的筛选结
          号20221123）购自上海安为生物科技有限公司。本研究
                                                              果，将细胞分为阴性对照血清组、阳性对照血清组、20%
          方案经广州迈尔斯生物科技有限公司动物伦理委员会
                                                              散剂血清组和20%汤剂血清组，每组设3个复孔。各组
          审批通过，批件号为20230014。
                                                              分别给予10%阴性对照血清、10%阳性对照血清和相应
          2 方法                                                浓度含药血清干预，于干预前及干预24、48 h（根据“3.1”
          2.1 药液的制备                                           项下结果设置）后，收集细胞，进行后续指标检测。
              三虫通络散结方由全蝎 10 g、壁虎 10 g、蜈蚣 6 g 组                2.4 指标检测
          成。取上述饮片，加入清水 300 mL，煎煮出药液 123                       2.4.1 细胞侵袭能力检测
          mL，药液质量浓度为 0.21 g/mL，于 4 ℃储存备用，即得                       采用 Transwell 实验检测。取对数生长期的 Lewis
          汤剂组药液。取三虫通络散结胶囊内容物，以生理盐水                            肺癌细胞，按“2.3.2”项下方法分组、处理。培养48 h后，
          为溶剂溶解稀释成相应浓度药液，即得散剂组药液。                             将 3×10 个细胞接种到涂有 Matrigel 基质胶的小室上
                                                                     4
          2.2 血清的制备                                           层，用200 μL无血清培养基重悬；在下室中加入完全培
              取 44 只 SD 大鼠，随机分为散剂组、汤剂组、阳性对                    养基700 μL，于37 ℃、5%CO2培养箱孵育48 h。孵育结
          照组和阴性对照组，每组11只。根据人的使用剂量，按                           束后，取出小室，吸弃上室培养基后，先将小室转移至加
                           [9]
          照体表面积折算法 换算大鼠的等效剂量，即散剂组大                            有多聚甲醛的 24 孔板中，固定 15 min，然后用棉签擦去
          鼠按 0.946 g/（kg·d）灌胃相应药液，汤剂组大鼠按 2.730                上室细胞，以磷酸盐缓冲液洗涤3次，再用4%多聚甲醛


          · 442 ·    China Pharmacy  2025 Vol. 36  No. 4                               中国药房  2025年第36卷第4期
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