Page 65 - 《中国药房》2025年4期

固定20 min，以磷酸盐缓冲液洗涤3次，最后用结晶紫染 3 结果
色10 min。使用显微镜观察细胞侵袭数量并拍照，细胞 3.1 三虫通络散结方含药血清的最佳干预浓度筛选

侵袭数量越多说明侵袭能力越强。 结果
2.4.2 细胞迁移能力检测 如图 1 所示，与干预前比较，5% 散剂血清组和 5%
采用细胞划痕实验检测。将消化生长状态良好的 汤剂血清组细胞干预 24、48、72 h 时的细胞增殖抑制率
细胞接种到 6 孔板中，细胞数量为确保常规培养第 2 天 呈先升高后降低的趋势，以干预 48 h 时的细胞增殖抑
刚好铺满板底。将细胞按“2.3.2”项下方法分组、处理， 制率最高；阳性对照血清组、10% 散剂血清组、20% 散

在 6 孔板上方放置无菌的尺子，用移液枪取 200 μL，枪 剂血清组、10% 汤剂血清组和 20% 汤剂血清组细胞干
头垂直于孔板，沿着尺子划痕，划痕完毕，吸弃旧培养 预 24、48、72 h 时的细胞增殖抑制率均明显升高，且与
基，用磷酸盐缓冲液洗涤3次，去除划下的细胞，使留下 作用时间呈正相关，其中干预 48 h 时，20% 散剂血清组
的划痕间隙肉眼可见，然后更换新鲜无血清培养基，于 和 20% 汤剂血清组细胞的细胞增殖抑制率均不低于
37 ℃、5%CO2培养箱培养24 h。使用显微镜观察划痕区 50%。故选取散剂血清和汤剂血清的最佳干预浓度均
宽度并拍照，计算细胞迁移距离：细胞迁移距离＝0 h划 为20%。

痕区域宽度－24 h划痕区域宽度。 80 阳性对照血清组
70 5%散剂血清组
2.4.3 细胞凋亡情况检测 10%散剂血清组
60 20%散剂血清组
采用流式细胞术检测。取对数生长期的Lewis肺癌 50 5%汤剂血清组
细胞，按“2.3.2”项下方法分组、处理。细胞培养48 h后， 细胞增殖抑制率/% 40 10%汤剂血清组
20%汤剂血清组
30
以胰酶消化，离心收集细胞，加入磷酸盐缓冲液 300 μL 20
10
重悬细胞，再次离心，弃上清液，加入 Binding Buffer 50
0
μL，混匀，加入 Annexin Ⅴ-FITC 和 PI 各 2.5 μL，室温避 －10 干预前 干预24 h 干预48 h 干预72 h
干预时间
光孵育 15 min，离心，弃上清液，加入 Binding Buffer 300 图1 含药血清对Lewis肺癌细胞增殖的影响（n＝3）
μL。使用流式细胞仪检测细胞凋亡情况，并计算细胞凋
3.2 细胞侵袭能力比较
亡率：细胞凋亡率＝（早期凋亡细胞数+晚期凋亡细胞
与阴性对照血清组比较，阳性对照血清组、20% 散
数）/总细胞数×100%。
剂血清组和 20% 汤剂血清组细胞的侵袭数量均显著减
2.4.4 细 胞 中 VEGF、HIF-1α、PHD2、MMP-2、ERK、
少（P＜0.05）。结果见图2和表1。
JNK、p38 MAPK蛋白表达检测
采用 Western Blot 法检测。取对数生长期的 Lewis
肺癌细胞，按“2.3.2”项下方法分组、处理。培养48 h后，
裂解细胞并提取蛋白，采用二辛可酸法测定蛋白浓度。
蛋白加热变性后，电泳分离并转至聚偏二氟乙烯膜上，
经脱脂粉封闭，加入 GAPDH、VEGF、HIF-1α、PHD2、 A.阴性对照血清组 B.阳性对照血清组

MMP-2、ERK、JNK、p38 MAPK 一 抗（稀 释 比 例 均 为
1∶1 000），于4 ℃孵育过夜；加入相应二抗（稀释比例均为
1∶1 000），室温孵育1 h，洗膜后加入ECL显色液曝光，扫
描。应用 Image J 软件分析电泳条带的灰度值，以目的
蛋白与内参蛋白（GAPDH）的灰度值比值表示目的蛋白 C. 20%散剂血清组 D. 20%汤剂血清组
的表达水平。 图2 各组细胞Transwell侵袭实验的显微图（结晶紫染
2.5 统计学方法 色，标尺＝100 μm）

采用SPSS 20.0软件对数据进行统计分析。所有数 3.3 细胞迁移能力比较
据以 x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一 如图3所示，与干预前比较，干预24 h时阳性对照血
步两两比较采用LSD-t检验。检验水准α＝0.05。 清组、20%散剂血清组和20%汤剂血清组细胞的划痕区

中国药房 2025年第36卷第4期 China Pharmacy 2025 Vol. 36 No. 4 · 443 ·