Page 64 - 《中国药房》2025年3期
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解），GLA+Compound C组（皮下注射400 μg/kg的GLA+               转移到PVDF膜上，用含5%脱脂奶粉的TBST在室温下
          0.2 mg/kg 的 AMPK 抑制剂 Compound C ），每组 10 只。          阻断 1 h，加入 β-actin（稀释度为 1∶1 000）、p-AMPK（稀
                                            [9]
          各给药组皮下注射相应药液，Sham组和KOA组大鼠注                          释度为 1∶2 000）、AMPK（稀释度为 1∶1 000）、p-mTOR
          射等量的生理盐水，每天1次，连续给药21 d。                            （稀释度为 1∶1 000）、mTOR（稀释度为 1∶1 000）、p-
          2.2 大鼠膝关节肿胀程度检测                                     ULK1（稀释度为 1∶1 000）、ULK1（稀释度为 1∶10 000）
              于给药第7、21天时，采用游标卡尺测量大鼠左右膝                        一抗在4 ℃下孵育过夜；用TBST洗涤10 min，加入二抗
          关节直径，计算右膝关节肿胀度（即右膝关节直径与左                           （稀释度为1∶5 000）在室温下孵育1 h，使用ECL试剂盒
          膝关节直径的差值）。                                          进行显色、成像。使用Image J软件进行分析，以β-actin
          2.3 样品采集                                            为内参进行归一化，以 p-AMPK 与 AMPK、p-mTOR 与
              测量完大鼠左右膝关节直径后，各组大鼠以颈椎                           mTOR、p-ULK1 与 ULK1 的比值表示 AMPK、mTOR、
          脱臼法处死，于眼眶采集全血标本，分离血清，保存于                            ULK1的磷酸化水平。
          －80 ℃。将右后肢膝关节软骨组织分成两部分：一部分                          2.9 统计学方法
          置于 10% 多聚甲醛中固定，用于病理学观察；另一部分                             采用SPSS 26.0软件对数据进行统计分析。符合正
          保存于－80 ℃，备用。                                        态分布的计量资料以x±s表示，组间比较用单因素方差
          2.4 大鼠血清中MMP-13、IL-1β水平检测                           分 析 ，组 间 两 两 比 较 采 用 SNK-q 检 验 。 检 验 水 准
              采用 ELISA 法检测。取“2.3”项下血清样品，按试                    α＝0.05。
          剂盒说明书方法操作，采用酶标仪于450 nm波长处测定                         3 结果
          吸光度，并绘制MMP-13、IL-1β的标准曲线，然后计算大                      3.1 GLA对KOA大鼠膝关节肿胀程度的影响
          鼠血清中MMP-13、IL-1β水平。                                     GLA 处理 7、21 d 后，KOA 组大鼠膝关节肿胀程度
          2.5 大鼠膝关节软骨组织病理学特征观察                                均显著高于Sham组（P＜0.05）；L-GLA、M-GLA、H-GLA
              取“2.3”项下固定的膝关节软骨组织适量，用水冲洗                       组大鼠膝关节肿胀程度均显著低于 KOA 组，且具有剂
          30 min，在乙二胺四乙酸中室温脱钙 4～6 周，每周更换                      量依赖性（P＜0.05）；GLA+Compound C 组大鼠膝关节
          脱 钙 液 ，然 后 用 水 冲 洗 30  min，用 不 同 浓 度 的 乙 醇          肿胀程度显著高于H-GLA组（P＜0.05）。结果见表1。
         （50%～100%）脱水，再以二甲苯透明，经石蜡包埋后制                         表1 各组大鼠膝关节肿胀程度比较（x±s，n＝10，mm）
          成5 μm切片；切片经苏木素染色10 min，再以伊红染色                       组别                       7 d            21 d
          3～5 min，然后在显微镜下观察其病理学特征。                            Sham组                  0.11±0.01      0.15±0.01
                                                              KOA组                  4.37±0.42 a     5.17±0.53 a
          2.6 大鼠软骨细胞自噬观察                                      L-GLA组                3.45±0.35 b     2.72±0.30 b
              取“2.3”项下冻存的膝关节软骨组织适量，修剪为                        M-GLA组                 3.11±0.32 bc   2.23±0.28 bc
                                                              H-GLA组                2.72±0.28 bcd   1.85±0.21 bcd
          1 mm×1 mm×1 mm大小，在四氧化锇（1%）中固定3 h，
                                                              GLA+Compound C组       3.62±0.37 e     3.69±0.41 e
          经脱水、包埋后，切成70 nm厚的薄片，再以柠檬酸铅、醋
                                                                 a：与Sham组比较，P＜0.05；b：与KOA组比较，P＜0.05；c：与L-
          酸铀进行双重染色，然后采用TEM观察，并统计自噬空                           GLA组比较，P＜0.05；d：与M-GLA组比较，P＜0.05；e：与H-GLA组比
          泡数。                                                 较，P＜0.05。
          2.7 大鼠软骨细胞凋亡检测                                      3.2 GLA 对 KOA 大鼠血清中 MMP-13、IL-1β 水平的
              取“2.3”项下冻存的膝关节软骨组织适量，用0.25%                     影响
          胰蛋白酶消化 10 min，加入 500 μL 结合缓冲液重悬，再                       KOA 组大鼠血清中 MMP-13、IL-1β 水平均显著高
          加入 5 μL Annexin Ⅴ-FITC 试剂和 5 μL 碘化丙啶（PI），           于 Sham 组（P＜0.05）；L-GLA、M-GLA、H-GLA 组大鼠
          室温下黑暗反应15 min，采用流式细胞仪检测软骨细胞                         血清中MMP-13、IL-1β水平均显著低于KOA组，且具有
          凋亡情况，并计算凋亡率（凋亡率＝凋亡细胞数/总细胞                           剂量依赖性（P＜0.05）；GLA+Compound C 组大鼠血清
          数×100%）。                                            中 MMP-13、IL-1β 水 平 均 显 著 高 于 H-GLA 组（P＜
          2.8 大鼠膝关节软骨组织中AMPK/mTOR/ULK1信号                      0.05）。结果见表2。
          通路相关蛋白表达检测                                          3.3 GLA对KOA大鼠膝关节软骨组织病理学的影响
              采用Western blot法检测。取“2.3”项下冻存的膝关                     Sham组大鼠膝关节软骨细胞排列整齐、形态规则，
          节软骨组织适量，用 RIPA 裂解液裂解，提取总蛋白，采                        组织结构完整，无炎症细胞浸润；KOA组大鼠膝关节软
          用BCA试剂盒检测上清液中的蛋白浓度。蛋白经变性                            骨细胞排列紊乱，细胞核固缩，关节软骨层纤维化严重，
          处理后，取50 μg至10%十二烷基硫酸钠凝胶上，并进行                        伴有大量炎症细胞浸润；与 KOA 组相比，L-GLA、M-
          十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。将分离的样品                            GLA、H-GLA 组大鼠膝关节软骨损伤得到明显改善，炎


          · 314 ·    China Pharmacy  2025 Vol. 36  No. 3                               中国药房  2025年第36卷第3期
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