Page 45 - 《中国药房》2025年3期
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组小鼠较空白组小鼠体重平均值增加20%以上，判断为                          向引物0.2 μL、反向引物0.2 μL，加水至10 μL。扩增条
                      [8]
          模型构建成功 。                                           件如下：95 ℃预变性 2 min；95 ℃变性 10 s，60 ℃退火
          2.2 实验取材                                           30 s，共循环 40 次。以 GAPDH 为内参，采用 2          －ΔΔCt 法计
              末次给药后，留取小鼠粪便，置于冻存管中，于－80 ℃                     算与脂肪合成与分解相关基因 的mRNA表达水平。引
                                                                                       [9]
          下冻存，备测；留取小鼠眼球血，置于 1.5 mL 离心管中，                     物序列及产物长度见表1。
          于2～8 ℃下静置2 h后，于4 ℃下以3 500 r/min离心15                            表1 引物序列及产物长度
          min，吸取上层血清，于－40 ℃下保存，备测；取少量肝                        基因             引物序列（5′→3′）             产物长度/bp
          脏组织，一部分置于 4% 多聚甲醛溶液中固定，备测，另                         GAPDH          正向：CCTCGTCCCGTAGACAAAATG  21
          一部分于－80 ℃下冻存，备测；取皮下腹股沟白色脂肪                                         反向：TGAGGTCAATGAAGGGGTCGT
                                                              Ppargc1α       正向：TCCGGCTGTTTGGTGACC     18
          组织（inguinal white adipose tissue，iWAT）、附睾白色脂
                                                                             反向：AACAGATGTGCCCCTGCC
          肪组织（epididymal white adipose tissue，eWAT）、肾周白       ACC1           正向：AAGCCCGTGAGAACACAGAG   20
          色脂肪组织（perirenal white adipose tissue，pWAT），称定                      反向：AGGGATACTGAGACGCCACT
          并记录质量，然后将一部分 eWAT 置于 4% 多聚甲醛溶                       COX7A1         正向：CCGTGTGGCAGAGAAGCA     18
                                                                             反向：GCCCAGCCCAAGCAGTAT
          液中固定，其余脂肪组织于－80 ℃下冻存，备测。
                                                              COX8B          正向：ACAGTGGTTCCCAAAGCCC    19
          2.3 小鼠脂肪指数的测定                                                      反向：CTGAGATCCCCACAGCCTG
              观察各组小鼠 iWAT、eWAT、pWAT 大小、厚度和颜                  2.8 统计学方法
          色，称定质量并按下式计算脂肪指数：脂肪指数＝脂肪
                                                                 采用 SPSS 23.0 软件对数据进行统计分析，并使用
          质量/小鼠体重。                                           GraphPad Prism 9.5 软件制图。满足正态分布的计量资
          2.4 小鼠血清血脂水平检测
                                                             料以 x±s 表示，多组间比较采用方差分析，进一步两两
              取“2.2”项下小鼠血清样本，根据相应试剂盒说明书
                                                             比较使用 LSD-t 检验。肠道菌群相关分析中，α、β 多样
          操作，使用酶标仪测定各组小鼠血清中TC、TG、LDL-C、
                                                             性以及菌群健康指数的分析组间比较采用 Wilcoxon 秩
          HDL-C水平。                                           和检验。检验水准α＝0.05。
          2.5 小鼠肝脏和脂肪组织病理形态观察                                3 结果
              取“2.2”项下固定的小鼠肝脏组织和 eWAT，采用苏
          木精-伊红（HE）染色，置于显微镜下观察小鼠上述组织                         3.1 蒲公英总黄酮对小鼠表观变化的影响
                                                                 在造模第 4 周时，模型组小鼠体重平均值增加 20%
          的病理形态变化，并拍照。
                                                             以上，说明造模成功。空白组小鼠体态正常，活泼好动。
          2.6 小鼠肠道菌群分析
                                                             与空白组比较，模型组小鼠体态宽胖，毛发油腻，身体倦
              取“2.2”项下各组小鼠粪便样本，使用粪便基因组
                                                             怠少动。与模型组比较，蒲公英总黄酮组小鼠体重降
          DNA提取试剂盒从小鼠粪便样本中提取细菌DNA。采
                                                             低，活动较为灵活，被毛油脂明显减少。
          用 16S rRNA（V3～V4）扩增子测序方法，使用测序仪分
                                                             3.2 蒲公英总黄酮对小鼠体重、进食量和脂肪质量的
          析小鼠肠道菌群的丰度及多样性。采用 QIIME 平台对
          序列进行生物信息学分析，其中序列同源性高于97%的                          影响
                                                                 实验期间，小鼠体重由高到低为模型组＞蒲公英总
          序列归属于相同的操作性分类单元（operational taxo‐
          nomic unit，OTU），基于 Greengenes 数据库（http：//green‐    黄酮组＞空白组，见图1A；体重上涨速率由高到低为模
          genes.secondgenome.com/）的选择策略选择OTU表。采              型组＞蒲公英总黄酮组＞空白组，见图1B。蒲公英总黄
          用 Shannon 和 Sobs 指数代表微生物中物种的 α 多样                  酮组小鼠的进食量与模型组比较，差异无统计学意义
          性 ，采 用 线 性 判 别 分 析（linear  discriminant  analysis，  （P＞0.05），见图1C。与模型组比较，蒲公英总黄酮组小
          LDA），以 LDA 评分绝对值≥3.0 作为标准，鉴别发挥潜                    鼠 iWAT、eWAT 的 脂 肪 指 数 显 著 降 低（P＜0.05），见
          在作用的关键细菌。基于美吉生物云平台（https：//                        图1D。
          www.majorbio.com/）分析肠道微生物组健康指数（gut                 3.3 蒲公英总黄酮对小鼠血脂水平的影响
          microbiome health index，GMHI），该值侧重确定患病的                与空白组比较，模型组小鼠血清 TC、TG、LDL-C 水
          可能性，独立于临床诊断，用以评估健康状况。根据未                           平均显著升高，HDL-C水平显著降低（P＜0.01）；与模型组
          加权的 UniFrac 距离，采用 QIIME 平台进行主坐标分析                  比较，蒲公英总黄酮组小鼠血清TC、TG、LDL-C水平均显
          用以展示微生物中物种的β多样性。                                   著降低，HDL-C水平显著升高（P＜0.01）。结果见表2。
          2.7 小鼠肝脏脂肪代谢相关基因表达的检测                              3.4 蒲公英总黄酮对小鼠肝脏和脂肪组织病理变化的
              取“2.2”项下各组小鼠冻存的肝脏组织，称取 20                      影响
          mg，提取总RNA。根据逆转录试剂盒说明书将RNA转                             小鼠肝脏组织病理切片结果显示，空白组小鼠肝细
          录为 cDNA。以 cDNA 为模板进行 qPCR 扩增。反应体                   胞未见任何病理改变；与空白组比较，模型组小鼠肝脏
          系包括：SYBR Green 混合液 5 μL、cDNA 样品 1 μL、正             可见大量肝细胞脂肪空泡变性；与模型组比较，蒲公英


          中国药房  2025年第36卷第3期                                                 China Pharmacy  2025 Vol. 36  No. 3    · 295 ·
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