Page 74 - 《中国药房》2025年2期
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          疗，但可因转移、复发而导致患者总体预后不佳。研究                            CD4 、CD8 荧光抗体和山羊抗兔、山羊抗鼠 IgG（H&L）
          指出，转移、免疫逃逸和对治疗的抵抗与GC患者的不良                           二抗（批号分别为 ab95591、ab210372、ab6702、ab6708）
                                                                                                 +
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                      [2]
          预后密切相关 。肿瘤细胞的免疫逃逸是其通过修饰自                            均购自英国Abcam公司；人CD4  T、CD8  T细胞检测试
          身表面抗原、募集抑制性免疫细胞/分子及改变肿瘤组织                           剂盒（货号分别为 TBDCH100154、TBDCH100140）均购
          周围微环境等途径来逃避机体免疫系统的监控、识别及                            自上海研瑾生物科技有限公司；人自然杀伤（natural
                                      [3]
          攻击，从而继续分裂生长的过程 。因此，了解 GC 细胞                         kill，NK）细胞检测试剂盒（货号 qy-1953R）购自齐一生
          的免疫逃逸机制并开发针对该机制的药物，对于 GC 的                          物科技（上海）有限公司；CCK-8 试剂（批号 96992）购自
          临床治疗具有重要的意义。                                        德国 Merck 公司；Annexin Ⅴ-FITC/PI 细胞凋亡检测试
              欧前胡素（imperatorin，IMP-SD）能抑制肿瘤细胞的                剂盒（批号 MA0220）购自大连美仑生物技术有限公司；
          活力，使细胞周期停滞，抑制喉癌、横纹肌肉瘤、骨肉瘤                           基质胶（批号AC-M082704）购自百普赛斯生物科技有限
          和 GC 等肿瘤细胞的增殖、迁移，并促进其凋亡                  [4―7] 。含   公司；Lipofectamine 2000 转染试剂（批号 11668019）购
          锌指和 BTB 结构域 7B（zinc finger and BTB domain 7B，       自美国 Thermo Fisher Scientific 公司；ThPOK 小分子干
          ThPOK）是 POZ 结 构 域 Krüppel 样 锌 指（POZ  domain         扰 RNA（si-ThPOK）及其阴性对照（si-NC）（批号分别为
          Krüppel-like zinc finger，POK）家族成员，对成熟辅助性            siB112503026314-1-5、siB108436814-123-1-5）均购自广
          T细胞的稳态和分化至关重要，可控制CD4  T细胞的分                         州市锐博生物科技有限公司。
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          化并调节其功能，在直肠癌、胸腺癌、GC 细胞的免疫逃                          1.3 细胞
          逸过程中具有重要作用          [8―9] 。ThPOK转录沉默元件可抑                人GC细胞MKN-7（货号CL-0574）购自武汉普诺赛
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          制 ThPOK 的表达，从而启动肠黏膜中 CD4 肠上皮淋巴                      生命科技有限公司；人外周血CD8  T细胞（货号PRI-H-
                                                                                           +
          细胞的分化 。可见，调控ThPOK的表达是调节T细胞                          00121）购自上海中乔新舟生物科技有限公司；人外周血
                    [10]
                                                                 +
          分化的重要机制。此外，过表达的ThPOK可减弱GC细                          CD4  T 细胞（货号 ABC-TC3993）购自北京百奥创新科
          胞的活力，增加 T 细胞的分化，并可通过诱导精子尾部                          技有限公司；人 NK 细胞（货号 CP-H168）购自武汉益普
          富含PG的重复序列1使胞外信号调节激酶信号通路失                            生物科技有限公司。
                                        [11]
          活，从而抑制 GC 细胞的免疫逃逸 。然而，IMP-SD 能                      2 方法
          否通过调节 ThPOK 的表达来影响 GC 细胞免疫逃逸等                       2.1 IMP-SD干预浓度筛选
          恶性生物学行为尚不明确。基于此，本研究拟探讨IMP-                              采用CCK-8法检测、筛选。取对数生长期的MKN-
          SD对GC细胞多种恶性生物学行为的影响，并探讨相应                           7细胞，按每孔3 000个接种于96孔板中，待细胞贴壁生
          作用的发挥是否与调控ThPOK的表达有关，以期为GC                          长后，分别加入含不同浓度 IMP-SD[0（对照）、20、40、
          有效治疗药物的研发及应用提供参考。                                   80、160、200 μmol/L ]的含胎牛血清、青-链霉素双抗的
                                                                               [12]
          1 材料                                                RPMI-1640培养基（以下称“完全培养基”），并设置不含
          1.1 主要仪器                                            药物、不含细胞的空白对照（每浓度设置6个复孔）。培
              本研究所有主要仪器包括NanoFCM型流式细胞仪                        养48 h后，每孔加入CCK-8试剂10 μL，孵育2 h，使用酶
                                              TM
         （厦门福流生物科技有限公司），ChemiDoc 型化学发光                        标仪在450 nm波长处检测各孔的吸光度，并计算细胞存
                         TM
          成像仪、Criterion 型垂直电泳仪（美国 Bio-Rad 公司），                活率[细胞存活率＝（实验孔吸光度值－空白对照孔吸
          CX40M 型显微镜[舜宇光学科技（集团）有限公司]，                         光度值）/（对照孔吸光度值－空白对照吸光度值）×
          Forma  Steri-Cult型CO2细胞培养箱、Multiskan SkyHigh        100%]和半数抑制浓度（IC50 ），以确定后续实验 IMP-SD
               TM
          型生物酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）等。              的低、中、高浓度。
          1.2 主要药品与试剂                                         2.2 MKN-7细胞分组与干预
              IMP-SD 对 照 品（批 号 M71520230321，纯 度 ≥                 取对数生长期的 MKN-7 细胞，随机分为对照组，
          95.0%）购自美国MSD公司；GC细胞专用培养基RPMI-                      IMP-SD 低、中、高浓度组（L-IMP-SD 组、M-IMP-SD 组、
          1640、胎牛血清、青-链霉素双抗溶液（货号分别为                           H-IMP-SD组），si-NC组和si-ThPOK组，每组设置6个复
          PM150110、164210-50、PB180120）均购自武汉普诺赛生               孔。对照组细胞加入完全培养基；IMP-SD 各浓度组细
          命科技有限公司；鼠源ThPOK单克隆抗体、鼠源程序性                          胞分别加入含相应浓度 IMP-SD（根据“2.1”项下结果设
          死亡受体 1（programmed death-1，PD-1）单克隆抗体、兔              置）的完全培养基；si-NC、si-ThPOK 组细胞经含高浓度
          源程序性死亡受体配体 1（programmed death-ligand 1，             IMP-SD 的 完 全 培 养 基 处 理 后 ，分 别 转 染 si-NC、si-
          PD-L1）单克隆抗体、兔源甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）                    ThPOK（以 si-NC 组的 ThPOK 表达较 H-IMP-SD 组基本
          多 克 隆 抗 体（货 号 分 别 为 GTX83353、GTX20256、              不变且 si-ThPOK 组的 ThPOK 表达较 H-IMP-SD 组显著
          GTX635975、GTX100118）均 购 自 美 国 GenTex 公 司 ；          下降为转染成功）。


          · 192 ·    China Pharmacy  2025 Vol. 36  No. 2                               中国药房  2025年第36卷第2期
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