Page 34 - 《中国药房》2025年2期
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82 g），混合，以10倍量水浸泡30 min后，武火煮沸，转文                    便湿重；于 60 ℃下恒温烘干 12 h 后，称定其干重，按下
          火煎煮 30 min，过滤；取药渣，同法再煎煮 1 次。合并 2                    式计算粪便含水率：粪便含水率＝（粪便湿重－粪便干
                                                                                [13]
          次水煎液，过滤，浓缩，得质量浓度为5.6 g/mL（以生药量                      重）/粪便湿重×100% 。
          计）的加味芍药甘草汤煎液。                                       2.4 大鼠肠道推进功能检测
          2.1.2 阳性对照药                                             采用墨汁灌胃法检测。结束上述指标检测后，随机
              取乳果糖口服溶液适量，用生理盐水制成质量浓度                          选取每组 4 只大鼠，禁食、不禁水 24 h，以墨汁 10 mL/kg
          为208.44 mg/mL的溶液，即配即用。                              灌胃，30 min 后以戊巴比妥钠 30 mg/kg 腹腔注射麻醉，
          2.1.3 复方地芬诺酯                                        再以颈椎脱臼法处死，随后立即剖开腹部，快速取出其
              将复方地芬诺酯片研磨为细粉，用生理盐水配制成                          肠道，在无张力的状态下测量大鼠的肠道全长及墨汁在
          质量浓度为1.5 mg/mL的混悬液，即配即用。                            肠道内的推进长度，按下式计算肠道推进率：肠道推进
          2.1.4 墨汁                                            率＝墨染肠管长度/肠道全长×100% 。
                                                                                             [13]
              取阿拉伯胶50 g，加水400 mL，混合，煮沸至澄清透                    2.5 大鼠肠内容物中GABA、5-HT含量的检测
          明，再加活性炭25 g，混匀并煮沸3次，冷却，用水定容至                            取每组剩余6只大鼠，按“2.4”项下方法麻醉、处死、
          500 mL，于4 ℃下保存，使用前搅拌均匀。                             解剖，快速取出其肠内容物，采用液相色谱-串联质谱法
          2.2 分组、造模与给药                                        检测其中GABA、5-HT含量。
              大鼠适应性饲养 3 d 后，按随机数字表法分为空白                          （1）色谱与质谱条件：色谱柱为 Agilent Eclipse Plus
          组（10只）和造模组（30只），雌雄各半。造模组大鼠参考                        C18 （3.0 mm×150 mm，1.8 μm），以 0.6% 甲酸溶液（A）-
          相关文献    [2，13―14] ，采用复方地芬诺酯[15 mg/（kg·d），每天         乙腈（B）为流动相进行梯度洗脱（0～0.3 min，98%A；
          1 次，连续 14 d]灌胃的方式构建 STC 模型；空白组大鼠                    0.3～5 min，98%A→90%A；5～10 min，90%A→10%A；
          灌胃等体积生理盐水。造模后，若大鼠出现体形干瘪瘦                            10～14.5 min，10%A→98%A），柱温为 35 ℃，进样量为
          小、毛发竖立、拱背、活动减少、粪便质量减轻及颗粒变                           5 μL。采用电喷雾离子源以多反应监测模式进行正离
          细等症状，大便 Bristol 评分较空白组显著降低，且首粒                      子扫描，用于定量分析的离子对分别为 m/z 104.1→87.1
          黑便排出时间（造模结束后立即禁食 24 h，经口灌入墨                        （GABA）、m/z 177.4→160.0（5-HT）。
          汁10 mL/kg。从灌胃完毕开始计时，记录首粒黑便排出                           （2）样品检测：精密称取各组大鼠的肠内容物 50
          时间）较空白组显著延长，则视为STC模型复制成功。                           mg，置于 2 mL EP 管中，加入－20 ℃预冷的 80% 乙腈
              造模期间大鼠无死亡，全部存活。将造模成功的大                          400 μL 沉淀蛋白，涡旋提取 20 min，于 4 ℃下以 12 000
          鼠随机分为模型组（10只），加味芍药甘草汤组（10只），                        r/min离心10 min；取上清液，以氮气流吹干，残渣以初始
          阳性对照药组（10只），雌雄各半。本课题组前期临床研                          流动相 100 μL 复溶，于 4 ℃下以 12 000 r/min 离心 10
          究表明，加味芍药甘草汤常规剂量治疗 STC 的疗效显                          min；取上清液，按上述色谱与质谱条件进样测定，记录
          著，故参考此剂量，予加味芍药甘草汤组大鼠相应药液                            峰面积，以外标法计算肠内容物中 GABA、5-HT 含量。
          56 g/（kg·d）（以生药量计）；同法予阳性对照药组大鼠相                     方法学考察结果显示，GABA、5-HT 检测质量浓度的线
          应药液2.09 g/（kg·d），空白组和模型组大鼠灌胃等体积                     性范围分别为 1.00～50.0、2.00～100 ng/mL（r＞0.999）；
          生理盐水；每天1次，连续14 d。                                   精密度、重复性等结果均符合2020年版《中国药典》（四
          2.3 大鼠一般情况观察及体重、Bristol 评分、粪便含水                     部）的相关要求。
          率检测                                                 2.6 大鼠肠道菌群检测
          2.3.1 一般情况观察                                            采用第三代 16S rRNA 高通量测序技术检测。取
              实验期间，观察各组大鼠的精神、活动、毛发、摄食、 “2.5”项下各组大鼠的肠内容物样本适量，使用相应试剂
          饮水等一般情况。                                            盒对样本进行基因提取和定量后，使用特定引物（515正
          2.3.2 体重、Bristol评分、粪便含水率检测                          向引物为5′-AGRGTTYGATYMTGGCTCAG-3′，806反
             （1）体重：观察各组大鼠实验期间的体重变化情况，                         向引物为5′-RGYTACCTTGTTACGACTT-3′，由杭州联
          并记录末次给药后各组大鼠的体重。                                    川生物技术股份有限公司设计、合成）扩增16S rRNA的
             （2）粪便 Bristol 评分：末次给药后，将大鼠单笼饲                    V1～V9区域。所得产物经回收、纯化后，使用蓝色荧光
          养，收集其 24 h 粪便，并按 Bristol 评分标准评估其粪便                  定量系统定量；以SMRTbell  Template制备试剂盒构建
                                                                                     TM
          性状，具体标准如下：粪便存在分散的硬块，似坚果，记1                          测序文库，并进行测序分析。采用DADA 2软件对测序
          分；粪便呈腊肠状，且成块，记2分；粪便呈腊肠状，但表                          数据进行去噪处理，得到扩增子序列变体（amplicon se‐
          面有裂缝，记 3 分；粪便似腊肠或蛇状，光滑柔软，记 4                        quence variants，ASV）特征序列和丰度表格，使用SILVA
          分；粪便为软团，边缘清楚，记5分；粪便似糊状、绒状物，                         数据库（https：//www.arb-silva.de）进行分类学注释，通过
          边缘不清，记6分；粪便为水样，无固状物，记7分 。                           Chao1、Goods_coverage、Shannon、Simpson 指 数（ 以
                                                   [13]
             （3）粪便含水率：取各组大鼠上述24 h粪便，称定粪                       Chao1 指数表征群落丰度，Shannon、Simpson 指数表征


          · 156 ·    China Pharmacy  2025 Vol. 36  No. 2                               中国药房  2025年第36卷第2期
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