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高60 cm、直径150 cm的圆形水池，用2个相互垂直的挡                      1∶5 000），常温孵育 2 h。采用 ECL 试剂显色，拍照，用
          板将水池分为4块，分别标记为1、2、3、4区域，水池中央                        Image Pro Plus 6.0软件分析蛋白条带灰度值。以目的蛋
          放1个距离水平面1 cm、直径12 cm的圆台。前5 d对大                      白与内参蛋白（β-actin）条带灰度值的比值表示目的蛋白
          鼠进行训练，置大鼠于平台上适应2 min后，将大鼠随机                         的表达水平，并计算p-ErbB4/ErbB4比值。
          放于任意一个区域，记录其游至平台的时间，如120 s内                         2.10 统计学方法
          仍未游至平台，则将大鼠引导至平台并且停留10 s。训                              采用 GraphPad Prism 8.0.1 软件进行数据的统计分
          练结束后撤掉平台，把大鼠从1、2、3、4任意区域放入水                         析。满足正态分布的计量资料以x±s表示，采用单因素方
          池，记录大鼠逃避潜伏期（寻找、游至原平台位置所需时                           差分析和SNK-q检验进行组间比较。检验水准α＝0.05。
          间）、目标象限滞留时间以及穿越平台次数。                                3 结果
          2.3 样本采集                                            3.1 Andro对大鼠神经功能的影响
              神经功能评分结束后，注射 3% 的戊巴比妥钠将大                            与 Sham 组比较，Model 组大鼠 Zea-Longa 评分、逃
          鼠麻醉，腹主动脉取血1 mL，以3 000 r/min离心10 min，                避潜伏期均显著升高/延长（P＜0.05），滞留时间、穿越平
          收集上层血清；取血后，断头处死大鼠，取出完整脑组                            台次数均显著缩短/减少（P＜0.05）。与 Model 组比较，
          织，冷冻保存，备测。                                          Andro-L 组、Andro-H 组大鼠 Zea-Longa 评分、逃避潜伏
          2.4 血清中LDH、TNF-α、IL-1β、IL-10、NGF水平测定                期均显著降低/缩短（P＜0.05），滞留时间、穿越平台次数
              取“2.3”项下血清，按照相应 ELISA 试剂盒说明书                    均显著延长/增加（P＜0.05），且 Andro-H 组上述指标的
          方法操作，采用酶标仪检测血清中LDH、TNF-α、IL-1β、                     变化较 Andro-L 组更明显（P＜0.05）。与 Andro-H 组比
          IL-10、NGF水平。                                        较，Andro-H+Dacomitinib 组大鼠 Zea-Longa 评分、逃避
          2.5 脑梗死面积测定
                                                              潜伏期均显著升高/延长（P＜0.05），滞留时间、穿越平台
              采用 TTC 染色法测定。各组分别取 5 只大鼠的脑
                                                              次数均显著缩短/减少（P＜0.05）。结果见表1。
          组织，置于－20 ℃冰箱中冷冻 20 min，然后进行冠状切
                                                               表1 各组大鼠神经功能评估结果比较（x±s，n＝15）
          片，用1%TTC溶液染色，37 ℃避光孵育30 min，拍照，采
                                                                                              水迷宫实验
          用Image Pro Plus 6.0软件分析脑梗死面积。                       组别           Zea-Longa评分/分
                                                                                      逃避潜伏期/s  滞留时间/s  穿越平台次数/次
          2.6 海马组织病理形态学变化观察                                   Sham组            0      12.36±1.57  49.24±5.51  14.82±1.74
              采用 HE 染色法观察。从各组剩余 10 只大鼠中另                      Model组         2.90±0.37 a  38.14±3.62 a  17.61±2.27 a  5.23±0.62 a
                                                              Andro-L组       2.10±0.28 b  30.72±3.48 b  26.58±3.49 b  8.46±0.91 b
          取5只大鼠的脑组织，用4%多聚甲醛固定、脱水、石蜡包埋
                                                              Andro-H组       1.20±0.16 bc  19.53±2.29 bc  38.12±4.35 bc  11.37±1.48 bc
          后切取含有海马完整结构的脑切片，经苏木精和伊红依                            Andro-H+Dacomitinib组  2.30±0.32 d  32.68±3.71 d  24.73±2.86 d  7.54±0.87 d
          次染色后，采用显微镜观察大鼠海马组织形态，并拍照。                              a：与Sham组比较，P＜0.05；b：与Model组比较，P＜0.05；c：与
          2.7 海马神经元凋亡检测                                       Andro-L组比较，P＜0.05；d：与Andro-H组比较，P＜0.05。
              采用 TUNEL 法检测。取“2.6”项下脑切片，按照                     3.2 Andro 对大鼠血清中 LDH、TNF-α、IL-1β、IL-10、
          TUNEL 试剂盒说明书方法操作，采用荧光显微镜观察                          NGF水平的影响
          并拍照，以Image J软件分析细胞凋亡情况（凋亡细胞呈                            与Sham组比较，Model组大鼠血清中LDH、TNF-α、
          绿色）。                                                IL-1β水平均显著升高（P＜0.05），IL-10、NGF 水平均显著
          2.8 海马组织中MDA、SOD、CAT水平检测                            降低（P＜0.05）；与Model组比较，Andro-L组和Andro-H
              称取每组最后 5 只大鼠的海马组织，加入 9 倍体积                      组大鼠血清中LDH、TNF-α、IL-1β水平均显著降低（P＜
          冰生理盐水，低温匀浆，以3 000 r/min离心10 min，取上                  0.05），IL-10、NGF水平均显著升高（P＜0.05），且Andro-
          清液，按照试剂盒说明书方法操作，采用紫外分光光度                            H组上述指标的变化较Andro-L组更明显（P＜0.05）；与
          计测定大鼠海马组织中MDA、SOD、CAT水平。                            Andro-H 组比较，Andro-H+Dacomitinib 组大鼠血清中
          2.9  海 马 组 织 中 MMP-9、cleaved-caspase-3、Nrg-1、       LDH、TNF-α、IL-1β 水平均显著升高（P＜0.05），IL-10、
          ErbB4蛋白表达检测                                         NGF水平均显著降低（P＜0.05）。结果见表2。
              采用Western blot法检测。定量称取“2.8”项下匀浆                 表2 各组大鼠血清中LDH、TNF-α、IL-1β、IL-10、NGF
          组织溶液，按蛋白提取试剂盒方法提取组织中的总蛋白，
                                                                   水平比较（x±s，n＝15）
          采用BCA试剂盒检测总蛋白浓度。以热水浴将蛋白变
                                                              组别          LDH/（U/mL） TNF-α/（pg/mL） IL-1β/（pg/mL） IL-10/（pg/mL） NGF/（pg/mL）
          性后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（电压                            Sham组       2.14±0.38  43.26±5.81  28.51±3.74  95.47±12.63 513.72±64.81
          120 V，电泳时间 60 min），然后电转至聚偏二氟乙烯膜                     Model组      9.46±1.56 a  184.57±24.76 a  131.46±17.83 a  20.52±2.86 a  172.53±23.67 a
                                                              Andro-L组    6.97±1.12 b  136.42±17.53 b  94.27±13.68 b  46.84±6.71 b  268.31±35.42 b
          上（电流400 mA，转膜时间90 min），5%脱脂奶粉室温封
                                                              Andro-H组    4.28±0.67 bc  79.83±11.27 bc  56.82±7.46 bc  72.38±9.42 bc  384.26±47.54 bc
          闭 2 h；加入 MMP-9、cleaved-caspase-3、Nrg-1、ErbB4、       Andro-H+Dacomitinib组 7.35±1.24 d  145.78±19.13 d  102.39±14.57 d  41.26±5.54 d  251.48±32.19 d
          p-ErbB4、β-actin一抗（稀释比例均为1∶1 500），4 ℃孵育                 a：与Sham组比较，P＜0.05；b：与Model组比较，P＜0.05；c：与
          过夜；磷酸盐缓冲液洗涤 3 次，加入二抗（稀释比例为                          Andro-L组比较，P＜0.05；d：与Andro-H组比较，P＜0.05。


          · 2636 ·    China Pharmacy  2024 Vol. 35  No. 21                            中国药房  2024年第35卷第21期
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