Page 46 - 《中国药房》2024年19期
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中，加入300 μL乙腈、20 μL 300 μg/mL的2-氯苯丙氨酸                速为40 arb；雾化器温度为350 ℃。
         （内标，下同），涡旋30 s，冰水浴超声提取20 min，然后于                     2.6 样品分析及数据处理
          4 ℃下以13 000 r/min离心5 min。取300 μL上清液，以               2.6.1 三七姜醇提物化学成分及代谢成分分析
          氮气吹干；加入 100 μL 超纯水复溶，涡旋 1 min，于 4 ℃                     取“2.4”项下各供试液和对照品溶液，每个样品取5
          下以 13 000 r/min 离心 5 min，取 80 μL 上清液作为血清            μL上清液混匀后得到质控（quality control，QC）样品，每
          供试液。                                                隔 6 个样本插入 1 个 QC 样品，分别按“2.5”项下条件进
          2.4.2 尿液样品供试液的制备                                    样分析。使用 MS-DIAL 软件对实验数据进行处理，将
              常温下解冻尿液样本后，取 500 μL 于 1.5 mL 离心                 得到的数据结果与 MassBank、京都基因与基因组百科
          管中，在 4 ℃下以 13 000 r/min 离心 5 min，取上清液过              全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）
          0.22 μm 水相滤膜；取 80 μL 滤液，加入 20 μL 内标（300             数据库进行比对，对各个色谱峰进行初步推测，得到化
          μg/mL），涡旋混匀，取80 μL作为尿液供试液。                          合物的准分子离子峰和二级碎片离子、分子式等信息，
          2.4.3 粪便样品供试液的制备                                    再结合相关文献及质谱裂解规律，进一步推断未知化
              取 10 mg 粪便样本，加入 1 mL 1% 甲酸-乙腈溶液，                合物。

          接着加入 20 μL 内标（300 μg/mL），涡旋 30 s，冰水浴超
                                                              2.6.2 数据处理与分析
          声提取 20 min，在 4 ℃下以 13 000 r/min 离心 5 min，取
                                                                  首先运用 Analysis Base File Converter 软件将原始
          800 μL上清液以氮气吹干；用100 μL 80%乙腈溶液（含
                                                              数据转化成通用（.abf）格式，并在MS-DIAL软件平台执
          1% 甲酸）复溶样本，涡旋 1 min，然后在 4 ℃下以 13 000
                                                              行包括峰的识别、保留时间校正、自动积分等诸多预处
          r/min离心5 min，取上清液80 μL作为粪便供试液。
                                                              理，获取代谢物编号、保留时间、m/z、名称、离子模式以
          2.4.4 对照品溶液的制备
                                                              及峰面积等信息。接下来，对样本中的feature数目进行
              分别精密称取“1.2”项下各对照品适量，置于10 mL
                                                              筛选，得到一个含有样本名称、一级质谱及二级质谱的
          容量瓶中，加甲醇溶解并定容，混匀，经 0.22 μm 微孔滤
                                                              匹配库定性结果，以及基于峰面积的相对定量的可视化
          膜滤过，取续滤液，即得质量浓度均为0.1 mg/mL的单一
                                                              矩阵。在此基础上，借助MetaboAnalyst 5.0平台通过主
          对照品溶液。
                                                              成分分析（principal component analysis，PCA）和偏最小
          2.4.5 三七姜醇提物供试液的制备
                                                              二乘法-判别分析（partial least squares-discriminant analy‐
              称取三七姜醇提物浸膏约 0.1 g，置于 100 mL 容量
                                                              sis，PLS-DA）等手段来分析代谢物，并结合变量重要性
          瓶中，用甲醇溶解并定容，即得质量浓度为 1 mg/mL 的
                                                              投影（variable importance in projection，VIP）值＞1、t 检
          三七姜醇提物供试液，备用。
                                                              验的 P＜0.05 筛选血清差异代谢物；通过 KEGG 进行血
          2.5 色谱及质谱条件
                                                              清差异代谢物的代谢通路富集分析，以通路影响值
          2.5.1 色谱条件
                                                             （pathway impact）＞0.2为标准，得出主要的代谢通路。
              色谱柱为 Waters HSS T3 柱（100 mm×2.1 mm，1.8
                                                              3 结果
          μm）；正离子模式下采用的流动相为含0.1%甲酸的水溶
                                                              3.1 三七姜醇提物化学成分及代谢成分分析结果
          液（A液）和含0.1%甲酸的甲醇溶液（B液），负离子模式
          下采用的流动相为含10 mmol/L甲酸铵的水溶液（A液）                           在正、负离子模式下，三七姜醇提物的化学成分以
                                                              及给药后大鼠尿液、粪便和血清样品中原型成分及其代
          和含10 mmol/L甲酸铵的95%甲醇溶液（B液），2种离子
          检测模式均采用相同的梯度洗脱条件（0～1 min，90%A；                      谢产物的总离子流图详见图1、图2。根据所得化合物相
          1～13 min，90%A→2%A；13～18 min，2%A；18～18.5 min，        关信息，结合相关文献、对照品图谱（限于篇幅，本文略）
          2%A→90%A；18.5～20 min，90%A）；流速为0.3 mL/min；           及质谱裂解规律，从三七姜醇提物中共鉴定出38个化合
          柱温为35 ℃；检测波长为254 nm；进样量为2 μL。                       物，包括10个黄酮及其苷类化合物、10个有机酸类化合
          2.5.2 质谱条件                                          物、4个酚类化合物、5个萜类化合物、2个生物碱类化合
              采用电喷雾离子源（ESI），选择正、负离子模式分开                       物和7个其他类化合物。从大鼠的尿液、粪便和血清样
          检测，离子源喷雾电压分别为3.8 kV（+）、3.2 kV（－）；一                  品中共鉴定出21个原型成分和3个代谢产物，其中从尿
          级分辨率为70 000（半峰全宽），二级分辨率为17 500（半                    液样品中鉴定出14个原型成分和3个代谢产物，从粪便
                                          2
          峰全宽）；扫描方式 为Full MS/dd-MS 模式，扫描范围为                   样品中鉴定出9个原型成分，从血清样品中鉴定出10个
          质荷比（m/z）100～1 500；毛细管温度为 300 ℃；鞘气流                  原型成分和1个代谢产物，详见表1。


          · 2360 ·    China Pharmacy  2024 Vol. 35  No. 19                            中国药房  2024年第35卷第19期
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