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2 方法                                                TRIzol 法提取组织中总 RNA，检测 RNA 的浓度和纯度
          2.1 分组、造模与给药                                        后，将其逆转录为cDNA，并以cDNA为模板进行PCR扩

              60只雌性SD大鼠均灌胃2.25 μg/mL的己烯雌酚促                    增。扩增体系包括上、下游引物各 1 μL，Taq 酶 0.5 μL，
          情 。次日清晨检查阴道涂片，若光镜下见大量阴道细                            6 μmol/L 氯化镁 2.5 μL，10×RNA PCR buffer 8 μL，加
            [9]
                          [10]
          胞脱落记为已动情 。将已动情的雌性SD大鼠与雄性                            入纯化水至总体积为 60 μL。各基因引物序列参照
          SD大鼠按照2∶1的比例合笼交配，次日清晨若见阴道栓                          Primer 5.0设计，委托宝生物工程（大连）有限公司合成，
          脱落记为孕1 d。结果，60只雌性SD大鼠共成功受孕58                        详细信息见表 1。反应程序如下：95 ℃预变性 5 min；
          只。采用随机数字表法将孕鼠分为6组，分别为正常组                            95 ℃变性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共40
         （纯化水，n＝10）、模型组（纯化水，n＝9）、阳性对照药组                       个循环；72 ℃再延伸10 min，结束反应。采用2              －ΔΔCt 法计
         （黄体酮4 mg/kg ，n＝9）和大豆异黄酮低、中、高剂量组                      算目的基因mRNA的表达水平。
                        [11]
                          [6]
         （25、50、100 mg/kg ，n＝10）。除正常组外，其余各组孕
                                                                     表1 各基因引物序列及扩增产物长度
          鼠均于孕8 d时采用米非司酮+米索前列醇灌胃造模，其                          基因                   引物序列             扩增产物长度/bp
          中米非司酮于当天08：00灌胃8.3 mg/kg，米索前列醇于                     Fas          上游：5′-CAAGTCCCTCCATGCCCATT-3′  782
                                                                           下游：5′-GCAAAATCTTTGCGGGGGTT-3′
          当天 18：00 灌胃 100 μg/kg 。各组大鼠分别于孕 1～7                 FasL         上游：5′-CCAGAGATCAGAGCGGTTCC-3′  127
                                 [10]
          d、孕 9～12 d 给以相应药物或纯化水（阳性对照药组肌                                    下游：5′-GGGATGCATGTCAGGTGTGT-3′
                                                              PCNA         上游：5′-ACTCTCTCAGGGGTGAAGCA-3′  596
          内注射给药，其余各组均灌胃给药），给药体积均为 10
                                                                           下游：5′-CATCCGCGCTTTCTGATTGG-3′
          mL/kg，每天给药1次。                                       HB-EGF       上游：5′-GTAAGGGTGTGGGAATGGGG-3′  333
          2.2 保胎率计算和血清β-HCG、P水平检测                                          下游：5′-GCGTGGTAGAGAGGGGTCTA-3′
                                                              β-actin      上游：5′-TCCTATGGGAGAACGGCAGA-3′  676
              孕 14 d 时，采取脊椎脱臼法处死大鼠，同时取其腹                                   下游：5′-TCCTTTGTCCCCTGAGCTTG-3′
          主动脉血3 mL。观察各组大鼠的胚胎：宫内未见瘀血、                          2.6 胎盘与蜕膜组织中Fas通路相关蛋白表达检测
          胚胎呈淡红色的为正常胚胎；宫内胚胎呈黑褐色，或有                                采 用 Western  blot 法 检 测 胎 盘 组 织 中 Fas、FasL、
          阴道出血史，解剖时子宫呈竹节状，宫腔内有瘀血或坏
                                                              PCNA、HB-EGF蛋白与蜕膜组织中Fas、PCNA、HB-EGF
          死胚胎的为流产胚胎。按下式计算保胎率：保胎率＝正
                                                              蛋白的表达情况。取胎盘和蜕膜组织，加入裂解液，冰
          常胚胎/（正常胚胎+流产胚胎）×100%。将血液样本在
                                                              浴中超声匀浆；在 4 ℃下以 12 000 r/min 离心 20 min，收
          室温下以 3 500 r/min 离心 10 min，取上清液，按试剂盒
                                                              集上清液，采用 BCA 法对总蛋白进行定量。将蛋白高
          说明书操作，于450 nm波长下检测并计算各组大鼠血清
                                                              温变性后，按 50 μL/孔上样进行 SDS-PAGE 电泳（分离
          中β-HCG、P水平。
                                                              胶 12%，浓缩胶 5%）。在样品进胶前设置电压为 100～
          2.3 胎盘与蜕膜组织病理形态学观察
                                                              200 V，电泳时间约15 min；当样品中溴酚蓝指示剂到达
              采用 HE 染色法进行观察。取各组大鼠胎盘（胎鼠
                                                              分离胶后将电压调至 200 V，当溴酚蓝指示剂迁移至距
          部分的羊膜组织）及蜕膜组织，常规制备石蜡切片（厚度
                                                              凝胶前沿 1～2 cm 时停止电泳。然后在 300 mA 电流下
          4 μm），参照HE染色试剂盒说明书处理，在光学显微镜
                                                              转膜30 min至聚偏二氟乙烯膜上，用脱脂奶粉封闭2 h。
          下观察其病理形态学变化。
                                                              加入 Fas、FasL、PCNA、HB-EGF、β-actin 一抗，4 ℃下孵
          2.4 胎盘与蜕膜组织细胞凋亡指数检测
                                                              育过夜；洗膜后，加入对应二抗，室温孵育1 h。显影，用
              采用TUNEL法进行检测。取各组大鼠胎盘及蜕膜
                                                              凝胶电泳成像分析系统观察并拍照，利用 Image J 软件
          组织，参照TUNEL试剂盒说明书处理，加二氨基联苯胺
          显色液，室温孵育。用甲基绿复染，脱水、透明后，用中                           对电泳条带进行分析，扫描蛋白条带灰度值，以各目的

          性树胶封片。镜下细胞核中可见棕黄色颗粒，记为凋亡                            蛋白与内参蛋白（β-actin）条带灰度值的比值表示目的蛋
          阳性细胞。凋亡指数＝凋亡阳性细胞数/总细胞数。                             白的表达水平。
          2.5 胎盘与蜕膜组织中 Fas 通路相关基因 mRNA 表达                     2.7 统计学方法
          检测                                                      采用 SPSS 21.0 软件进行统计分析。采用 Shapiro-
              采用逆转录定量PCR法检测胎盘组织中Fas、FasL、                     Wilk法检验计量资料的正态性，符合正态分布的数据用
          PCNA、HB-EGF mRNA 与蜕膜组织中 Fas、PCNA、HB-                x±s描述，并采用单因素方差分析和SNK-q检验进行组
          EGF mRNA的表达情况。取胎盘和蜕膜组织，分别采用                         间比较。检验水准α＝0.05。


          · 1484 ·    China Pharmacy  2024 Vol. 35  No. 12                            中国药房  2024年第35卷第12期
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