Page 73 - 《中国药房》2024年11期
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[丙氨酸转氨酶（alanine transaminase，ALT）、天冬氨酸转            滴染色面积占视野面积的百分比（简称脂滴染色面积占
          氨酶（aspartate transaminase，AST）]和脂代谢指标[甘油           比）。每张切片随机选择5个不同视野进行分析，结果取
          三酯（triglyceride，TG）、总胆固醇（total cholesterol，TC）、    平均值。
          低 密 度 脂 蛋 白 胆 固 醇（low-density  lipoprotein  choles‐    采用糖原染色法观察小鼠肝组织中糖原合成情况。
          terol，LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（high-density lipo‐          取部分切片常规脱蜡至水，经高碘酸氧化液浸泡 10～
          protein cholesterol，HDL-C）]检测。当造模组小鼠肝组             20 min、Schiff液染色10 min、苏木精复染2～3 min、乙醇
          织结构紊乱，肝细胞出现明显脂肪变性，肝功能、脂代谢                          分化、二甲苯透明后，以中性树胶封固。采用Pannoramic
          指标水平较正常组小鼠出现显著异常时，表明造模成                            250型数字切片扫描仪对切片进行图像采集，采用Image
            [7]
          功 。取造模成功的小鼠40只随机分为模型组（生理盐                          Pro Plus 6.0软件统计糖原染色面积，并计算糖原染色面
          水）、阳性对照组（多烯磷脂酰胆碱胶囊，23.30 mg/kg，剂                   积占视野面积百分比（简称糖原染色面积占比）。每张
          量参考文献[8]设置）和五味保肝丸低、中、高剂量组                          切片随机选择5个不同视野进行分析，结果取平均值。
         （0.11、0.23、0.45 g/kg，剂量根据人与小鼠体表面积换算                 2.4 小鼠血清中FFA和肝组织中炎症因子水平的检测
          而得，中剂量为临床等效剂量），每组8只。药物组小鼠                              采用 ELISA 法检测。取“2.2”项下保存的小鼠血清
          灌胃相应药物，模型组和正常组小鼠灌胃等体积生理盐                           和肝脏样品，根据试剂盒说明书方法检测小鼠血清中
          水，每天1次，连续4周。                                       FFA水平以及肝组织中炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β水平。
          2.2 小鼠糖代谢、肝功能、脂代谢指标检测                              2.5 小鼠肝组织中IRS/PI3K/AKT/GSK3β信号通路相
              给药期间，每周测量小鼠体重，观察小鼠体重变化                         关蛋白表达的检测
          情况。末次给药结束后，各组小鼠空腹 12～16 h，取尾                           采用 Western blot 法检测。取“2.2”项下－80 ℃条
          尖血，测空腹血糖和空腹胰岛素，并计算胰岛素抵抗指                           件下保存的肝组织适量，经裂解后，提取总蛋白。经
                                                       [9]
          数（胰岛素抵抗指数＝空腹血糖×空腹胰岛素/22.5） 。                       BCA法定量后，加热使蛋白变性。取30 μg蛋白样品上
          处死小鼠并称重，取血，血样以3 000 r/min离心10 min，                 样，经 10% 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离
          留取血清，于－70℃条件下保存。取血完成后解剖小
                                                             后，转移至聚偏二氟乙烯膜上；用5%脱脂牛奶封闭1 h，
          鼠，取肝脏，并计算肝指数[肝指数＝肝脏质量（mg）/体                        加入IRS1（稀释度为1∶1 000）、p-IRS1（稀释度为1∶1 000）、
          重（g）]。将肝脏分成 3 份，其中 2 份于－80 ℃条件下保
                                                             PI3K（稀释度为 1∶2 000）、p-PI3K（稀释度为 1∶1 000）、
          存，1 份于 4% 多聚甲醛中固定。取血清样品，采用动物
                                                             AKT（稀释度为1∶2 000）、p-AKT（稀释度为1∶1 000）、p-
          生化分析仪检测血清中肝功能指标（ALT、AST）和脂代
                                                             GSK3β（稀释度为1∶1 000）、GSK3β（稀释度为1∶1 000）
          谢指标（TC、TG、HDL-C、LDL-C）水平。
                                                             和 β-actin（稀释度为 1∶2 000）一抗，于 4 ℃下孵育过夜；
          2.3 小鼠肝组织病理学形态以及纤维化、脂滴形成和糖                         加入相应二抗（稀释度为 1∶4 000）于 37 ℃孵育 2 h。采
          原合成情况观察
                                                             用化学发光剂显色，采用 Image J 软件分析蛋白条带灰
              采用HE染色法对小鼠肝组织病理学形态进行观察                         度 值 ，以 p-IRS1 与 IRS1、p-PI3K 与 PI3K、p-AKT 与
          和评分。取于 4% 多聚甲醛中固定的肝组织适量，经梯
                                                             AKT、p-GSK3β与GSK3β的灰度值比值分别表示IRS1、
          度乙醇脱水、石蜡包埋、切片（4 μm）后，取部分切片（剩                       PI3K、AKT、GSK3β蛋白的磷酸化水平。
          余部分进行 Masson 染色、油红 O 染色、糖原染色）以二
                                                             2.6 统计学方法
          甲苯脱蜡、梯度乙醇脱苯；常规HE染色、封片后，采用光
                                                                 采用SPSS 25.0统计软件分析数据。计量资料通过
          学显微镜观察小鼠肝组织病理学形态变化。每张切片                            Shapiro-Wilk检验进行正态性检验，均服从正态分布，以
                                           [10]
          随机选择5个视野进行肝组织病理评分 。                                - x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两
              采用Masson染色法观察小鼠肝组织的纤维化进展
                                                             两比较采用SNK-q检验。检测水准α＝0.05。
          情况。取部分切片常规脱蜡至水，然后进行染色、水洗、
          乙醇分化、磷钼酸溶液处理、乙醇脱水、二甲苯透明后，                          3 结果
          以中性树胶封固。采用Pannoramic 250型数字切片扫描                    3.1 五味保肝丸对NAFLD小鼠肝功能的影响
                                                                 与正常组相比，模型组小鼠肝指数，血清中 ALT、
          仪对切片进行图像采集，采用Image Pro Plus 6.0软件对
                                                             AST水平，肝组织病理评分、纤维化染色面积占比、脂滴
          纤维化染色面积进行统计，并计算纤维化染色面积占视
                                                             染色面积占比均显著升高（P＜0.05）；肝组织中出现大
          野面积的百分比（简称纤维化染色面积占比）。每张切
          片随机选择5个不同视野进行分析，结果取平均值。                            量坏死的肝细胞和脂肪变性细胞，纤维化病变严重。与
                                                             模型组相比，阳性对照组和五味保肝丸中、高剂量组小
              采用油红 O 染色法观察小鼠肝组织中脂滴形成情
          况。取部分切片常规脱蜡至水，以甲醛固定 10 min、油                       鼠上述指标均显著逆转（P＜0.05），五味保肝丸低剂量
          红 O 染液染色 10 min、苏木精复染后，以甘油封片。采                     组小鼠上述部分指标显著逆转（P＜0.05）；各给药组小
          用BA210Digital型数码显微镜对切片进行图像采集，采                     鼠肝细胞坏死和脂肪变性程度均减弱，纤维化病变均减
          用Image Pro Plus 6.0软件统计脂滴染色面积，并计算脂                 轻。结果见图1和表1。


          中国药房  2024年第35卷第11期                                              China Pharmacy  2024 Vol. 35  No. 11    · 1347 ·
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