Page 51 - 《中国药房》2024年11期
P. 51

mg/kg腹腔注射1%链脲佐菌素溶液，72 h后尾静脉取血                      于电子显微镜下采集图像并观察各组大鼠肾组织病理
          检测血糖，血糖≥16.7 mmol/L 为 DM 模型造模成功 。                  形态学变化，测量肾小球基底膜厚度。
                                                      [12]
          造模组中有 1 只大鼠不符合成模标准予以剔除，有 1 只                       2.7  大 鼠 肾 组 织 中 P-cadherin、nephrin、α -SMA、
          大鼠造模后死亡，30只大鼠造模成功。将造模成功的大                          WT1、Col-ⅣⅣ、TGF-β1 mRNA表达的检测
          鼠随机分为模型组、厄贝沙坦组（阳性对照）和桃红四物                              采用实时定量PCR法检测。取“2.2”项下冻存的肾
          汤加味组，每组10只。桃红四物汤加味组大鼠灌胃桃红                          组 织 ，采 用 TRIquick 提 取 肾 组 织 总 RNA，反 转 录 成
          四物汤加味颗粒 6.48 g/（kg·d）（以生药量计算，依据前                   cDNA 进行扩增（引物序列和产物大小见表 1），反应条
          期研究最佳剂量设置），厄贝沙坦组大鼠灌胃厄贝沙坦                           件为：95 ℃预变性 30 s；95 ℃变性 15 s，60 ℃退火延伸
          13.5 mg/（kg·d）（按临床常用剂量换算），正常组和模型                   30 s，共 40 个循环。以 β-actin 为内参，采用 2      －ΔΔCt 法定量
          组大鼠灌胃等体积纯化水，每日 1 次，连续干预 16 周。                      分析肾组织中 P-cadherin、nephrin、α-SMA、WT1、Col-
          干预期间，正常组大鼠给予普通饲料喂养，其余各组大
                                                             Ⅳ、TGF-β1 mRNA表达水平。
          鼠均给予高糖高脂饲料喂养；每4周检测1次大鼠血糖，
                                                                         表1 引物序列和产物大小
          选取血糖大于≥16.7 mmol/L的大鼠继续实验。干预期
                                                              基因          引物序列（5′→3′）                产物大小/bp
          内共有5只（模型组2只、厄贝沙坦组2只、桃红四物汤加                          β-actin     正向引物ACCCGCGAGTACAACCTTCT     266
          味组1只）大鼠死亡，1只（桃红四物汤加味组）大鼠因血                                      反向引物TTCAGGGTCAGGATGCCTCT
                                                              P-cadherin  正向引物AGCGTGGTCTCCGAGTCCTA     117
          糖恢复正常予以剔除，每组最终均纳入8只。
                                                                          反向引物TCCAGCCAATGCCTCTTTCT
          2.2 标本的收集                                           nephrin     正向引物CTATGCCCTCTTCAAATGCACG   135
              于各组大鼠灌胃干预的第 4、8、12、16 周末，以代谢                                反向引物TATGCTGACAACCTTCAGTCCC
          笼收集 24 h 尿液并记录尿量，取尿液 1.5 mL，离心，冻                    α-SMA       正向引物CCGACCGAATGCAGAAGGA      126
                                                                          反向引物ACAGAGTATTTGCGCTCCGGA
          存。末次给药后，将各组大鼠禁食8 h后麻醉，于腹主动                          WT1         正向引物TCTTCCGAGGCATTCA         325
          脉采血，离心，冻存血清；快速分离肾组织，分别留取肾                                       反向引物TGGGTCTTCAGGTGGTC
          皮质于甲醛-乙酸-乙醇固定液、4%戊二醛固定液及冻存                          Col-Ⅳ       正向引物GGCCCCTGCTGAAGCGTT       139
                                                                          反向引物GTTCCCCGAGCACCTTAG
          管中。
                                                              TGF-β 1     正向引物ATGGTGGACCGCAACAAC       329
          2.3 大鼠体重、饮水量、饮食量、尿量、空腹血糖的检测                                     反向引物TGAGCACTGAAGCGAAAGC
              末次给药后，对各组大鼠称重，并记录其 24 h 的饮                     2.8 大鼠肾组织中 P-cadherin、nephrin、α-SMA、WT1
          水量、饮食量、尿量；禁食 12 h 后采集大鼠尾静脉血，检
                                                             蛋白表达的检测
          测空腹血糖。
                                                                 采用免疫组织化学法检测。取“2.2”项下冻存的肾
          2.4 大鼠不同时间点24 h尿蛋白的检测
                                                             组织，固定后以石蜡包埋，切片，脱蜡，微波修复，滴加P-
              取“2.2”项下收集的24 h尿液样本，按试剂盒说明书
                                                             cadherin、nephrin、α-SMA、WT1一抗（稀释比例分别为1∶
          方法检测各组大鼠被干预第4、8、12、16周末的24 h尿蛋
                                                             200、1∶200、1∶100、1∶200），于 4 ℃孵育过夜，滴加二抗
          白（24 h urine total protein，24 h UTP）。
                                                            （稀释比例为 1∶200），孵育，以 DAB 显色、苏木精复染、
          2.5 大鼠肾功能指标的检测
                                                             乙醇梯度脱水后透明并封片，于显微镜下采集图像并观
              取“2.2”项下冻存的血清样本，应用全自动生化分析
                                                             察肾组织中 P-cadherin、nephrin、α-SMA、WT1 蛋白表达
          仪检测各组大鼠血肌酐（serum creatinine，Scr）、尿素氮
                                                             情况。
         （blood urea nitrogen，BUN）水平。
                                                             2.9 大鼠肾组织中TGF-β1、Col-ⅣⅣ蛋白表达的检测
          2.6 大鼠肾组织病理形态学观察
                                                                 采用蛋白质印记法检测。取“2.2”项下冻存的肾组
          2.6.1 光镜观察
                                                             织，提取总蛋白，用 BCA 法测定浓度，以 100 ℃变性 5
              取“2.2”项下甲醛-乙酸-乙醇固定液中的肾皮质样
                                                             min。取变性后的蛋白50 μg，于4 ℃、120 V条件下进行
          本，以乙醇梯度脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、切片（厚度
          2 μm）、二甲苯脱蜡、乙醇梯度水化，进行过碘酸六胺银                        十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，以 5% 脱
         （periodic acid silver methenamine，PASM）+Masson染色，   脂奶粉封闭液封闭1 h，加入β-actin、TGF-β1、Col-Ⅳ一抗
          封片，于显微镜下采集图像并观察各组大鼠肾组织病理                          （稀释比例分别为1∶1 000、1∶500、1∶500），于4 ℃摇床孵
          形态学变化。                                             育过夜；洗膜后避光加入二抗（稀释比例为 1∶10 000），
          2.6.2 电子显微镜观察                                      于37 ℃摇床避光孵育1 h后洗膜，采用ECL化学发光法
              取“2.2”项下4%戊二醛固定液中的肾皮质样本，用                      显色。用红外激光扫描仪曝光、拍照，使用Image J软件
          1%锇酸固定后，以丙酮梯度脱水，丙酮和树脂混合液中                          分析荧光条带的灰度值，以目的蛋白与内参蛋白（β-ac‐
          浸透，环氧树脂包埋，切片，醋酸铀、柠檬酸铅双重染色，                         tin）的灰度值比值表示目的蛋白的表达水平。


          中国药房  2024年第35卷第11期                                              China Pharmacy  2024 Vol. 35  No. 11    · 1329 ·
   46   47   48   49   50   51   52   53   54   55   56