Page 30 - 《中国药房》2024年9期
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1.3 实验动物 脑，冰上剥离组织，取100 mg海马组织块，按质量（g）∶体
SPF级Wistar大鼠，共52只，体重（220±10） g，雌雄 积（mL）＝1∶9 的比例加入 9 倍体积的冷双蒸水，匀浆后
各半，由维通利华实验动物技术有限公司提供，动物生 制成匀浆液，水浴煮沸后离心取上清进行后续操作。按
产许可证号为 SCXK（京）2021-0006。大鼠饲养于山西 照试剂盒说明书制备相应试剂，采用酶标仪检测吸光度
中医药大学实验动物房，环境温度（22±2） ℃，相对湿度 （A）值，并根据以下公式计算组织中的ATP含量：ATP含
（50±10）%，自由昼夜光照，自由进食、进水。本实验通 量（μmol/g prot）＝（A 测定 －A 对照 ）/（A 标准 －A 空白 ）×c 标准 ×
过山西中医药大学实验动物伦理审查委员会批准，伦理 N÷c pr 。c 标准 ：标准品浓度，1 000 μmol/L；N：样本测定前
编号为2021DW031。 稀释倍数；c pr ：匀浆蛋白浓度。
2 方法 2.5 大鼠海马组织线粒体结构的观察
2.1 分组、造模与给药 采用透射电镜观察。取“2.4”项下各组大鼠海马组
3
实验大鼠分为正常组（n＝8）和造模组（n＝44）。大 织约 1 mm 为检测样本，置于电镜固定液（4 ℃）中。取
鼠适应性喂养 7 d 后，造模组采用“自由落体撞击法”制 出海马组织先用 0.1 mol/L PBS 漂洗 3 次，每次 15 min。
备 MCC 大鼠模型，每日撞击 1 次，连续 3 d，撞击部位为 之后滴加1%锇酸避光室温固定2 h，再用0.1 mol/L PBS
大鼠额颞叶部，撞击条件为：高度 100 cm，撞击物质量 漂洗 3 次，每次 15 min。漂洗结束后将组织以 30%、
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150 g。每次撞击后若符合下列条件则视为造模成功 ： 50%、70%、80%、95%、100%、100%的梯度依次进行乙醇
（1）撞击后动物立刻出现一过性呼吸暂停，但不超过20 s 脱水，每次 20 min，继续用丙酮脱水 2 次，每次 15 min。
即恢复正常呼吸节律；（2）动物出现短暂的角膜反射、针 然后进行渗透包埋和聚合，用超薄切片机切片，再用2%
刺疼痛反应、翻正反射消失，但不超过 3 min，恢复后无 醋酸铀饱和乙醇溶液避光染色 8 min，用 2.6% 枸橼酸铅
任何行动障碍。 溶液避 CO2染色 8 min。等室温干燥后通过透射电镜观
将造模成功的大鼠采用随机数字表法分为模型组、 察线粒体结构，并采集图像进行分析。
吡拉西坦组（阳性对照药）和脑震宁颗粒低、中、高剂量 2.6 大鼠海马组织线粒体分裂、融合蛋白表达的检测
组，每组 8 只。通过人/大鼠体表面积换算后，计算出药 采用免疫荧光法检测。取“2.5”项下透射电镜所剩
物等效剂量（70 kg的人，以每日50 g药物的临床剂量标 的石蜡切片，每组各取6个样本，脱蜡至水后进行抗原修
准为中剂量，1/2 中剂量为低剂量，2 倍中剂量为高剂 复，修复完成后，自然冷却。切片置于PBS中洗涤3次，
量）。各给药组大鼠按吡拉西坦组0.324 g/kg，脑震宁颗 每次 5 min。干燥后用组化笔圈出脑组织范围，滴加牛
粒低、中、高剂量组 2.25、4.5、9 g/kg 的剂量灌服相应药 血清白蛋白，封闭 30 min。滴加一抗（线粒体分裂蛋白
物。正常组和模型组大鼠灌服等体积生理盐水。所有 Drp1、Fis1和线粒体融合蛋白Mfn1、Opa1稀释度均为1∶
大鼠每天灌服1次，连续14 d。 200），4 ℃孵育过夜。切片于 PBS 中洗涤 3 次，每次 5
2.2 大鼠运动探索能力的评估 min，滴加二抗（稀释度均为 1∶300），避光室温孵育 50
采用旷场实验进行评估。给药14 d之后，首先清理 min。采用 DAPI 复染细胞核后，加入自发荧光淬灭剂 5
实验箱，消除气味的影响，之后将大鼠快速放入实验箱 min，流水冲洗10 min。室温晾干，抗荧光淬灭封片剂封
的中央，打开录像系统，记录其在5～10 min内的旷场活 片。电子显微镜下观察并采集图像，采用 Image J 软件
动轨迹，计算大鼠的水平运动总路程、中央格进入次数、 对其荧光强度进行统计分析，以荧光强度反映蛋白表达
静止时间、直立次数，评估其运动探索能力。 水平，荧光强度值越高表明蛋白表达水平越高。
2.3 大鼠学习记忆能力的评估 2.7 大鼠海马组织线粒体生物合成和通路蛋白表达的
采用新物体识别实验进行评估。在给药的最后 3 检测
d，每天抚摸大鼠1～2 min。测试时，将A、B两个球形物 采用Western blot法检测。取“2.4”项下大鼠海马组
体放入正方形箱子中，开启录像设备，记录 10 min 内大 织，每组各取 6 个样本，用 RIPA 裂解液提取蛋白，BCA
鼠与A、B两物体的接触情况，结束后放入饲养笼；1 h之 试剂盒测定组织蛋白浓度，加入 5×蛋白上样缓冲液后
后，将 B 物体换成立方体形状的 C 物体，记录 2～5 min 加热变性，制胶加样进行电泳、转膜，脱脂奶粉封闭2 h，
内大鼠与 A、C 两物体的接触情况。运用新物体识别指 加入 TBST 稀释的一抗（PGC-1α、NRF-1、TFAM、Wnt-
数来评估大鼠的学习记忆能力。新物体识别指数＝tC/ 3a、β-catenin 的稀释度均为 1∶1 000，β-actin 的稀释度为
（tB+tC ）×100%，其中tB为探索旧物体B的时间，tC为探索 1∶30 000），4 ℃孵育 12～18 h 过夜。次日用 TBST 洗脱
新物体C的时间。 3次，每次10 min，加入稀释后的二抗（稀释度为1∶10 000
2.4 大鼠海马组织线粒体ATP含量的检测 或1∶5 000），常温孵育60 min。TBST洗脱后，加入ECL
给药 14 d 之后，大鼠麻醉后腹主动脉取血，开颅取 发光染液显影，凝胶成像分析仪拍摄图像，采用Image J
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