Page 73 - 《中国药房》2024年6期
P. 73

基质胶的 Transwell 小室评估 KG-1 细胞的迁移能力，具                 2.3 统计学方法
          体操作如下：取对数生长期的KG-1细胞，用不含血清的                             采用SPSS 25.0软件对数据进行统计分析。数据以
                                     5
          RPMI 1640 培养基重悬至 4×10 个/mL；取上述细胞悬                  x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两
          液 100 μL 置于 Transwell 上室，同时将含 10% 胎牛血清             组间比较采用SNK-q检验。检验水准α＝0.05。
          的 RPMI 1640 培养基 600 μL 置于 Transwell 下室，于           3 结果
          37 ℃下孵育24 h。将上层细胞按“2.1.3”项下方法分组、
                                                             3.1 细胞实验结果
          处理后，收集穿膜细胞，以 4% 多聚甲醛固定后，再用
                                                             3.1.1 PD干预浓度筛选结果
          0.05% 结晶紫染液染色 2 h。使用显微镜观察各组细胞
                                                                 10、30、60、90、120 μmol/L 的 PD 对 BMMC 活力均
          的侵袭、迁移情况并记录侵袭、迁移细胞数。
                                                             无显著影响（P＞0.05），表明其对该细胞无明显毒性。
          2.1.7 PD对KG-1细胞上清液中cAMP水平的影响考察
                                                             与对照组比较，10、30、60、90、120 μmol/L 的 PD 均可显
              采用 ELISA 法检测。取对数生长期的 KG-1 细胞，
                                                             著降低 KG-1 细胞活力（P＜0.05），且其对 KG-1 细胞的
          按“2.1.3”项下方法分组、处理。收集各组细胞，用 PBS
                                                             半数抑制浓度（IC50）接近 60 μmol/L，因此选择 10、30、
          洗涤 3 次，以 1 500×g 离心 10 min，取上清液，使用酶标
                                                             60  μmol/L 作 为 后 续 实 验 PD 的 干 预 浓 度 。 结 果
          仪于 450 nm 波长处检测 cAMP 水平。具体操作严格参
                                                             见图1。
          照相应试剂盒说明书执行。
                                                                       150
          2.1.8 PD对KG-1细胞EMT相关蛋白和PKA蛋白表达                                                       BMMC
                                                                                               KG-1细胞
          的影响考察
              采用 Western blot 法检测。取对数生长期的 KG-1                         100
          细胞，按“2.1.3”项下方法分组、处理。收集各组细胞，用                               细胞活力/%  50  a  a
          PBS 洗涤 2 次，以裂解液裂解，再于 4 ℃下以 12 000×g                                         a     a     a
          离心 10 min，收集上清液，测定蛋白含量后作加热变性                                  0
          处理。取变性蛋白，进行 10% 十二烷基硫酸钠-聚丙烯                                   0（对照）     20          40          60          80         100        120
                                                                                 PD浓度/（μmol/L）
          酰胺凝胶电泳分离，并转移至聚偏二氟乙烯膜上，于室
                                                                a：与对照组比较，P＜0.05。
          温下以 5% 脱脂奶粉封闭 1 h；洗膜后，加入 E-cadherin、                   图1 PD干预浓度筛选的折线图（x±s，n＝6）
          vimentin、Snail、PKA、GAPDH 一抗（稀释比例分别为 1∶
                                                             3.1.2 PD对KG-1细胞活力和凋亡的影响
          2 000、1∶2 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶2 000），于 4 ℃下孵
                                                                 与正常组比较，PD各浓度组细胞的OD值均显著降
          育过夜；洗膜后，加入相应二抗（稀释比例为 1∶4 000），
                                                             低，凋亡率均显著升高，均呈浓度依赖性（P＜0.05）；而
          于室温下孵育2 h，使用ECL显色试剂盒显影，于凝胶成
                                                             SQ22536 组细胞的 OD 值显著升高，凋亡率显著降低
          像仪下成像。使用Image J 1.8.0软件分析各蛋白的灰度
                                                            （P＜0.05）。与 H-PD 组比较，H-PD+SQ22536 组细胞的
          值，并计算目的蛋白的相对表达量[目的蛋白的相对表
                                                             OD值显著升高，凋亡率显著降低（P＜0.05）。结果见表
          达量＝目的蛋白的条带灰度值/内参蛋白（GAPDH）的条
                                                             1、图2。
          带灰度值]。
          2.2 动物实验                                           表1 各组KG-1细胞OD值和凋亡率比较（x±s，n＝6）
              取对数生长期的KG-1细胞，以PBS配制细胞悬液。                       组别      OD值      凋亡率/%  组别         OD值   凋亡率/%
          取上述悬液，按 1×10 个/只接种于裸鼠右侧腋窝皮下。                        正常组    0.88±0.09  14.76±1.62  H-PD组  0.34±0.03 abc  29.48±3.16 abc
                            7
          接种后 15 d，将 24 只裸鼠分为对照组、PD 组、SQ22536                 L-PD组  0.72±0.08 a  18.51±1.91 a  SQ22536组  0.99±0.15 a  10.04±1.27 a
                                                              M-PD组  0.51±0.06 ab  23.95±2.52 ab  H-PD+SQ22536组 0.83±0.07 d  17.68±1.79 d
          组、PD+SQ22536 组，每组 6 只。PD 组裸鼠腹腔注射 5
                                                                a：与正常组比较，P＜0.05；b：与L-PD组比较，P＜0.05；c：与M-PD
          mg/kg 的 PD（以 0.1%DMSO 为溶剂，剂量参考相关文
                                                             组比较，P＜0.05；d：与H-PD组比较，P＜0.05。
          献 [11]  设 置），SQ22536 组 裸 鼠 腹 腔 注 射 3.2  mg/kg 的
          SQ22536（以 0.1%DMSO 为溶剂，剂量参考相关文献              [12]  3.1.3 PD对KG-1细胞迁移、侵袭的影响
          设置），PD+SQ22536 组裸鼠腹腔注射 5 mg/kg 的 PD 和                  与正常组比较，PD各浓度组的迁移、侵袭细胞数均
          3.2  mg/kg 的 SQ22536，对 照 组 裸 鼠 腹 腔 注 射             显著降低，均呈浓度依赖性（P＜0.05）；而SQ22536组的
          0.1%DMSO，每天 1 次，连续 4 周。末次给药次日，所有                   迁移、侵袭细胞数均显著升高（P＜0.05）。与H-PD组比
          裸鼠经麻醉后处死，取出其瘤体并称重，同时计算瘤体                           较，H-PD+SQ22536 组的迁移、侵袭细胞数均显著升高
          体积（瘤体体积＝肿瘤长度×肿瘤宽度×肿瘤宽度/2）。                        （P＜0.05）。结果见图3、表2。


          中国药房  2024年第35卷第6期                                                 China Pharmacy  2024 Vol. 35  No. 6    · 703 ·
   68   69   70   71   72   73   74   75   76   77   78