Page 72 - 《中国药房》2024年6期
P. 72

[4]
          细胞凋亡来抑制 AML 的发展，但具体机制尚未明确 。                         州市中心人民医院动物伦理委员会审核批准（编号
          上 皮 - 间 充 质 转 化（epithelial  mesenchymal  transition，  2020-10-171）。
          EMT）是指上皮细胞通过特定程序转化为具有间质表型                           2 方法
          特征细胞的生物学过程，是肿瘤得以进展的重要分子机                            2.1 细胞实验
                [5]
          制之一 。EMT过程涉及多种标志蛋白，包括锌指转录                           2.1.1 细胞培养
          因子 Snail、上皮钙黏素（E-cadherin）和波形蛋白（vimen‐                  将 BMMC 和 KG-1 细胞分别接种于含 10% 胎牛血
               [6]
          tin）等 。环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，        清 的 RPMI  1640 培 养 基 中 ，于 37  ℃ 、5%CO2 条 件 下
          cAMP）/蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）是AML研究             培养。
          领域的常见通路，激活该信号通路可抑制 AML 细胞的                          2.1.2 PD干预浓度筛选
          增殖，对 AML 的治疗具有积极效果              [7―8] ；此外，cAMP/         采用 MTT 法检测。收集 BMMC 和 KG-1 细胞，按
                                            [9]
          PKA 信号通路还可参与调控 EMT 进程 。结合现有文                        1×10  个/mL、每孔 100 μL 接种在 96 孔板上，培养 24 h
                                                                   4
          献，本研究拟基于EMT和cAMP/PKA信号通路，初步探                        待细胞进入对数生长期时，以不同浓度[0（对照）、10、
                                                                                      [4]
          讨PD对AML细胞增殖、迁移、侵袭的影响，并通过构建                          30、60、90、120 μmol/L]的 PD 继续培养 24 h，每浓度设
          裸鼠移植瘤模型，从体内水平初步验证PD的抗AML活                           置6个复孔，并设置只含培养基的空白孔。随后，在每孔
          性，以期为AML的治疗药物开发提供参考。                                中加入5 mg/mL的MTT试剂25 μL，室温孵育4 h后，加
          1 材料                                                入二甲基亚砜（DMSO）100 μL，充分振荡后，使用酶标
          1.1 主要仪器                                            仪于 570 nm 波长处检测各孔的光密度（OD）值，计算细
              本研究所用主要仪器包括 iMark680 型多功能酶标                     胞活力[细胞活力（%）＝（OD 实验组－OD 空白孔）/（OD 对照组－
          仪、Gel Doc EZ 型凝胶成像仪（美国 Bio-Rad 公司），                 OD 空白孔）×100%]，并根据检测结果筛选后续实验的 PD
          FACS Calibur 流式细胞仪（美国 BD Biosciences 公司），           干预浓度。
          Eclipse Ti-S型倒置显微镜（日本Nikon公司）等。                     2.1.3 细胞分组与处理
          1.2 主要药品与试剂                                             取对数生长期的KG-1细胞，分为正常组，低、中、高
              PD 对照品（批号 20210407，纯度≥98%）购自滁州                  浓度PD组（L-PD、M-PD、H-PD组），SQ22536组，高浓度
          仕诺达生物科技有限公司；cAMP 抑制剂 SQ22536 对照                     PD 和 SQ22536 联用组（H-PD+SQ22536 组），每组设置 6
          品（批号 HY-100396，纯度 98.41%）购自美国 MedChem‐              个复孔。正常组细胞正常培养24 h，L-PD、M-PD、H-PD
          Express 公司；Annexin Ⅴ-FITC/PI 双染细胞凋亡检测试              组细胞分别以10、30、60 μmol/L的PD（浓度参考相关文
                                                                [4]
          剂盒购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司；MTT细                           献 和“2.1.2”项下结果设置）培养 24 h，SQ22536 组细胞
          胞增殖及毒性检测试剂盒购自江西艾博因生物科技有                             以 100 μmol/L 的 cAMP 抑制剂 SQ22536（浓度参考相关
          限公司；兔源vimentin、Snail、E-cadherin、PKA、甘油醛-3-          文献 设置）培养 24 h，H-PD+SQ22536 组细胞同时以
                                                                  [10]
          磷酸脱氢酶（GAPDH）单克隆抗体和辣根过氧化物酶标                          60 μmol/L的PD和100 μmol/L的SQ22536培养24 h。
          记 的 山 羊 抗 兔 IgG 二 抗（货 号 分 别 为 ab92547、              2.1.4 PD对KG-1细胞活力的影响考察
          ab229701、ab40772、ab75991、ab9485、ab6721）均购自英             采用MTT法检测。取对数生长期的KG-1细胞，按
          国 Abcam 公司；cAMP 酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂                  “2.1.3”项下方法分组、处理，随后按“2.1.2”项下方法检
          盒购自上海酶联生物科技有限公司；RPMI 1640 培养                        测各组细胞的OD值，用以表示其活力。
          基、ECL显色试剂盒均购自北京索莱宝科技有限公司。                           2.1.5 PD对KG-1细胞凋亡的影响考察
          1.3 细胞与实验动物                                             采用流式细胞术检测。取对数生长期的 KG-1 细
              人AML细胞KG-1（批号CL-0132）购自武汉普诺赛                    胞，按“2.1.3”项下方法分组、处理。收集各组细胞，于室
          生命科技有限公司；人原代正常骨髓单核细胞（bone                           温下以 1 000×g 离心 5 min，用预冷的磷酸盐缓冲液
          marrow mononuclear cells，BMMC；批号 905810）购自北        （PBS）洗涤 3 次，再用 Annexin Ⅴ结合缓冲液 500 μL 重
          京诺为生物技术有限公司。                                        悬；于避光环境下，加入 Annexin Ⅴ-FITC、PI 试剂各 5
              SPF 级雄性 BALB/c 裸鼠（4～6 周龄，体重 18～20               μL，染色 15 min，使用流式细胞仪检测各组细胞的凋
          g）24 只，购自山东博安生物技术股份有限公司，动物生                         亡率。
          产许可证号为 SCXK（鲁）2020 0006。所有动物均饲养                     2.1.6 PD对KG-1细胞侵袭、迁移能力的影响考察
          于每 12 h 光照/黑暗交替、温度 18～23 ℃、相对湿度                         采用 Transwell 实验检测。用上室涂有基质胶的
          55%～65%的环境中，自由摄食、饮水。本研究方案经滕                         Transwell 小室评估 KG-1 细胞的侵袭能力，用上室未涂


          · 702 ·    China Pharmacy  2024 Vol. 35  No. 6                               中国药房  2024年第35卷第6期
   67   68   69   70   71   72   73   74   75   76   77