Page 63 - 《中国药房》2024年6期

PNS低剂量组、PNS高剂量组、PNS高剂量+2ME2组，每
组10只；另选10只正常SD大鼠，仅进行背部脱毛处理，
作为对照组。PNS低、高剂量组大鼠分别于创面组织处
肌内注射 15、30 mg/cm 的 PNS（取血塞通注射液，以生
2
理盐水稀释，制成25、50 mg/mL的药液，注射量均为0.6
2
[6]
mL/cm ，下同） ，同时腹腔注射 10 mL/kg 的生理盐水；
PNS 高剂量+2ME2 组大鼠于创面组织处肌内注射 30
2
mg/cm 的 PNS，同 时 腹 腔 注 射 4 mg/kg 的 2ME2（取
2ME2，以生理盐水稀释，制成0.4 mg/mL的药液，注射量
[7]
为 10 mL/kg） ；模型组、对照组大鼠于创面（或脱毛处）
2
组织处肌内注射0.6 mL/cm 的生理盐水，同时腹腔注射
10 mL/kg 的生理盐水。各组大鼠均于每天早上 8：00－
9：00给药1次，持续3周。
2.2 大鼠创面愈合率检测与标本采集
分别于造模成功时和末次给药结束 24 h 时观察各
组大鼠（除对照组外）的创面并拍照，使用 Image J 软件
进行定量后再按下式计算创面愈合率：创面愈合率＝末
次给药结束 24 h 时大鼠创面面积/造模成功时大鼠创面
面积×100%。
采集各组大鼠尾静脉血，于 4 ℃下以 500×g 离心
10 min，收集血清，于－20 ℃下保存，备用。随后，大鼠
经麻醉后断颈处死，剪下其创面组织（对照组大鼠剪下
背部脱毛处的皮肤组织，下同），其中一部分冻存于液氮
中，备用；剩余部分经包埋后以液氮迅速冷冻，取出后切
片，备用。
2.3 大鼠创面组织的微血管密度和 collagen Ⅰ、FN 表
达检测
采用免疫组织化学法检测。取“2.2”项下各组大鼠
的创面组织切片，于预冷丙酮中固定10 min；取出，用水漂
洗后以3%过氧化氢孵育5 min；加入CD31、collagen Ⅰ、
FN一抗（稀释比例分别为1∶200、1∶100、1∶150），于4 ℃
下孵育 13 h；经 DAB 染色后，用水漂洗，封片，使用显微
镜观察并拍摄。使用Image J软件定量分析创面组织中
微血管[以单个 CD31 阳性表达细胞（呈棕色或深棕色，
下同）或多个 CD31 阳性表达细胞聚成的细胞簇为 1 个
微血管]数量和视野切片面积，按下式计算微血管密度
（microvascular density，MVD）：MVD＝微血管数量/视野
切片面积；同时，使用Image J软件定量分析创面组织中
collagen Ⅰ、FN阳性表达细胞（呈棕色或深棕色）的光密
度值，用以表示两者的表达水平。
2.4 大鼠血清中血管生成相关因子、血清及创面组织中
炎症因子水平检测
采用 ELISA 法检测。取“2.2”项下各组大鼠冻存的
创面组织适量，剪碎，与 RIPA 裂解液混合后，于冰水浴
中高速研磨；所得匀浆液于 4 ℃下以 500×g 离心 10
min，收集上清液，以 BCA 法测定蛋白浓度后，使用
中国药房 2024年第35卷第6期
ELISA 法以酶标仪测定创面组织中炎症因子（IL-6、IL-
2）水平。取“2.2”项下各组大鼠的血清样品，使用ELISA
法以酶标仪测定血清中血管生成相关因子（VEGF、Ang-
Ⅰ、Ang-Ⅱ）和炎症因子（IL-6、IL-2）水平。上述检测均
严格按照相应试剂盒说明书进行。
2.5 大鼠创面组织中 HIF-1α/VEGF/VEGFR2 信号通
路相关蛋白表达检测
采用Western blot法检测。取“2.4”项下各组大鼠剩
余的创面组织适量，同法匀浆、离心、定量。取变性（沸
水浴处理）蛋白适量，经电泳分离后以湿法转膜，用 5%
脱 脂 奶 粉 封 闭 2.5 h；加 入 HIF-1α、VEGF、VEGFR2、
GAPDH一抗（稀释比例分别为1∶1 000、1∶2 000、1∶2 500、
1∶1 000），于摇床上孵育 3 h（4 ℃）；洗膜 3 次后，加入相
应二抗（稀释比例均为 1∶1 000），在摇床上孵育 2 h（室
温）；洗膜3次后，以化学发光法显色，并使用凝胶成像分
析系统成像。以Image J软件定量分析各目的蛋白的条
带灰度值，按下式计算其相对表达量：目的蛋白相对表
达量＝目的蛋白条带灰度值/内参蛋白（GAPDH）条带灰
度值。
2.6 统计学方法
使用 GraphPad Prism 8.0 软件对数据进行统计分
析。计量资料以x±s表示，多组间比较采用单因素方差
分析，进一步两组间比较采用 SNK-q 检验。检验水准
α＝0.05。
3 结果
3.1 PNS对大鼠创面愈合率的影响
PNS低、高剂量组大鼠创面愈合率均较模型组显著
升高（P＜0.05），且 PNS 高剂量组显著高于低剂量组
（P＜0.05）；PNS 高剂量+2ME2 组大鼠创面愈合率较
PNS高剂量组显著降低（P＜0.05）。结果见表1。
表1 各组大鼠创面愈合率、MVD比较（x±s，n＝10）
组别 创面愈合率/% MVD/（个/mm）
2
对照组 － 3.46±0.58
模型组 43.01±4.30 5.10±0.73 a
PNS低剂量组 65.83±5.17 b 9.21±0.92 b
PNS高剂量组 83.92±5.84 bc 13.95±1.04 bc
PNS高剂量+2ME2组 46.13±4.52 d 5.36±0.97 d
a：与对照组比较，P＜0.05；b：与模型组比较，P＜0.05；c：与PNS低
剂量组比较，P＜0.05；d：与PNS高剂量组比较，P＜0.05。
3.2 PNS对大鼠创面组织MVD和collagen Ⅰ、FN表达
的影响
模型组大鼠创面组织中微血管明显，MVD 较对照
组显著升高（P＜0.05）；PNS 低、高剂量组大鼠创面组织
中微血管明显增加，MVD 均较模型组显著升高（P＜
0.05），且 PNS 高剂量组显著高于低剂量组（P＜0.05）；
PNS 高剂量+2ME2 组大鼠创面组织 MVD 较 PNS 高剂
量组显著降低（P＜0.05）。结果见表1、图1。
China Pharmacy 2024 Vol. 35 No. 6 · 697 ·