Page 57 - 《中国药房》2024年6期
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2.2 大鼠运动功能检测                                       度。取各组大鼠蛋白样品适量，经加热变性、电泳分离
              末次给药结束24 h后，各组大鼠腹腔注射阿扑吗啡                       后转膜，以脱脂奶封闭 1 h；洗膜后，加入 SIRT1、p-NF-
          5 mg/kg 诱导旋转，并于 10 min 后记录其在 30 min 内的             κB p65、NF-κB p65、β-actin一抗（稀释比例分别为1∶1 100、
                                         [11]
          旋转圈数，用以评估大鼠的运动功能 。                                 1∶1 200、1∶1 200、1∶1 500），4 °C下孵育过夜；洗膜后，加
          2.3 大鼠认知功能检测                                       入相应二抗（稀释比例均为1∶2 200），室温下孵育2 h；以
              旋转实验结束后，采用Morris水迷宫实验检测各组                      ECL试剂显影后，于凝胶成像系统下成像。以β-actin为
          大鼠的认知功能：往直径 2 m 的水池（平分 4 个象限）中                     内参，采用 Image J 软件分析各组大鼠黑质纹状体中
          注水，注水高度为 30 cm。在第 1 象限放入平台并没入
                                                             SIRT1、p-NF-κB p65、NF-κB p65 蛋白的相对表达量，再
          水面下2 cm。将各组大鼠自每个象限正中面壁放下，训
                                                             以 p-NF-κB p65、NF-κB p65 蛋白的相对表达量之比
          练其找到平台；5 d后撤去平台，将各组大鼠再次自每个
                                                            （p-NF-κB p65/NF-κB p65）表示 NF-κB p65 蛋白磷酸化
          象限正中面壁放下，记录其找到平台所用时间（即逃避
                                                             水平。
          潜伏期）及在目标象限（即第1象限）停留时间。
                                                             2.8 统计学方法
          2.4 样品采集及大鼠黑质区、海马组织 CA1 区神经元
                                                                 使用SPSS 26.0软件对数据进行统计分析。计量资
          形态检测
                                                             料以 x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间
              认知功能检测实验结束后，各组大鼠吸入乙醚麻
                                                             两两比较采用SNK-q检验。检验水准α＝0.05。
          醉，于颈主动脉采血3 mL，以3 400 r/min离心14 min后，
          分离上层血清，于－80 ℃下保存，备用。将大鼠断头处                         3 结果
          死，分离每组6只大鼠的黑质纹状体适量并分成2份，其                          3.1 大鼠运动和认知功能的检测结果
          中一份剪碎后研磨，所得匀浆以6 000 r/min离心21 min                      与假手术组比较，模型组大鼠旋转圈数、逃避潜伏
          后，吸取上清液，于－80 ℃下保存，备用；另一份经液氮                        期均显著增加或延长，目标象限停留时间显著缩短（P＜
          速冻后，再于－80 ℃下保存，备用。                                 0.05）；与模型组比较，七叶皂苷钠低、高剂量组大鼠旋转
              分离每组剩余 6 只大鼠的黑质区和海马组织 CA1                      圈数、逃避潜伏期均显著减少或缩短，目标象限停留时
          区，经清洗后进行常规固定、脱水、石蜡包埋、切片；每组                         间均显著延长，且高剂量组的变化较低剂量组明显（P＜
          随机选择黑质区和海马组织 CA1 区切片各 3 张，水化                       0.05）；与七叶皂苷钠高剂量组比较，七叶皂苷钠+EX527
          后，按 HE 染色试剂盒说明书步骤染色后，常规脱水、透                        组大鼠旋转圈数、逃避潜伏期均显著增加或延长，目标
          明、封片，在显微镜下观察黑质区和海马组织 CA1 区的                        象限停留时间显著缩短（P＜0.05）。结果见表1。
          神经元形态。                                             表1 各组大鼠旋转圈数、逃避潜伏期、目标象限停留时
          2.5 大鼠黑质纹状体中DA含量及黑质区TH、α-Syn蛋                           间的比较（x±s，n＝12）
          白表达水平检测                                             组别               旋转圈数       逃避潜伏期/s  目标象限停留时间/s
              取“2.4”项下各组大鼠的黑质纹状体匀浆上清液样                        假手术组              0         12.08±2.92  42.92±4.08
          品，解冻后，按ELISA试剂盒说明书方法操作，使用酶标                         模型组             252.75±34.25 a  57.67±6.33 a  15.75±1.75 a
                                                              七叶皂苷钠低剂量组       152.08±20.92 b  42.58±5.42 b  24.75±2.25 b
          仪检测其中 DA 含量；取“2.4”项下各组大鼠黑质区切                        七叶皂苷钠高剂量组       73.58±0.42 bc  28.92±5.08 bc  34.08±4.92 bc
          片，水化后，加入TH、α-Syn一抗（稀释比例均为1∶150），                    七叶皂苷钠+EX527组    248.83±32.17 d  56.75±7.25 d  16.07±1.83 d
          按SP免疫组织化学试剂盒说明书方法进行免疫组织化                              a：与假手术组比较，P＜0.05；b：与模型组比较，P＜0.05；c：与七叶
          学染色后，常规脱水、透明、封片，在显微镜下观察 TH、                        皂苷钠低剂量组比较，P＜0.05；d：与七叶皂苷钠高剂量组比较，P＜
                                                             0.05。
          α-Syn蛋白着色情况，以Image J软件分析两者阳性细胞
                                                             3.2 大鼠黑质区和海马组织CA1区神经元形态的检测
         （呈棕色或深棕色）的光密度，用以表示各组大鼠黑质区
                                                             结果
          TH、α-Syn 蛋白的表达水平，结果以假手术组为标准进
                                                                 假手术组大鼠黑质区和海马组织 CA1 区神经元排
          行归一化处理。
                                                             列规整且形态结构完整；模型组大鼠黑质区和海马组织
          2.6 大鼠血清中炎症因子水平检测
              取“2.4”项下各组大鼠的血清样品，解冻后，按                        CA1 区神经元损伤严重，细胞膜皱缩，细胞核发生不规
          ELISA试剂盒说明书方法操作，以酶标仪检测血清中促                         则形变且染色质固缩，细胞排列散乱且体积明显缩小，
          炎因子IL-6、IL-18及抗炎因子IL-10水平。                         神经元数量明显变少；相较于模型组，七叶皂苷钠低、高
          2.7 大鼠黑质纹状体中SIRT1/NF-κB信号通路相关蛋                     剂量组大鼠黑质区和海马组织 CA1 区神经元的损伤程
          白表达水平检测                                            度均减轻；相较于七叶皂苷钠高剂量组，七叶皂苷钠+
              取“2.4”项下各组大鼠冻存的黑质纹状体样品，研碎                      EX527 组大鼠黑质区和海马组织 CA1 区神经元损伤严
          后，以蛋白裂解液裂解，采用 BCA 法测定其总蛋白浓                         重。结果见图1、图2。


          中国药房  2024年第35卷第6期                                                 China Pharmacy  2024 Vol. 35  No. 6    · 691 ·
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